组织工程肌腱细胞研究模型的构建:SD大鼠尾腱细胞可行吗?

背景:目前常用的动物肌腱研究模型(比如兔,罗曼鸡等)的培养方法存在周期长,细胞获取量少等不足,往往成为制约肌腱组织工程实验研究进程的瓶颈。目的:希望建立SD大鼠鼠尾肌腱细胞培养流程,以期用较短时间获取大量种子细胞,为更高的工程化肌腱构造研究创造模型构建条件。设计、时间及地点:对比观察,于2006-02/11在四川大学生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。材料:7～10dSD大鼠2只用于获取鼠尾腱细胞;第4代人包皮成纤维细胞由四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室提供。方法:选用SD乳鼠,无菌条件下抽取尾腱,体积分数为10%的小牛血清+DF培养基悬浮组织块培养法获得鼠尾肌腱原代细胞,将第3代细胞与人包皮成纤维细胞为对照,行Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫细胞化学染色,染色结果用image-proplus 5.02行吸光度测量,并做统计分析。主要观察指标:SD大鼠尾腱细胞免疫细胞化学染色结果及染色吸光度测量结果。结果:第2代SD大鼠尾腱细胞Ⅰ型胶原染色呈阳性,Ⅲ型胶原染色呈阴性;人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学皆呈阳性。尾腱细胞和人成纤维细胞Ⅰ型胶原表达吸光度值均明显高于Ⅲ型胶原(P<0.05)。两种细胞Ⅲ型胶原表达吸光度值与空白对照之间差异无显著性意义(P>0.05)。结论:SD乳鼠尾腱源细胞符合肌腱细胞的生物学特性。采用组织块悬浮培养可以在短期内大量获取原代或传代尾腱细胞。

猪小肠黏膜下层与兔骨髓间充质干细胞的体外复合培养

背景:小肠黏膜下层细胞外基质材料免疫原性低,具有良好生物相容性,是构建单一结构工程化组织的较好支架材料。目的:观察体外兔骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合培养的生物相容性。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化培养兔骨髓间充质干细胞,在其接种前用红色免疫荧光标记,然后将第2代已标记的兔骨髓间充质干细胞接种在猪小肠黏膜下层上。结果与结论:①组织学观察:骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层上复合培养1周时细胞呈单层生长,荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞显示均匀红色荧光,复合培养2周细胞呈多层生长,并显示更密集的红色荧光。②扫描电镜观察:复合培养2d,骨髓间充质干细胞黏附于材料表面并伸展;复合培养1周,小肠黏膜下层被骨髓间充质干细胞分泌的胶原覆盖;2周后细胞在材料上已大量增殖形成融合,细胞连接紧密,细胞分泌大量基质,并分层。表明小肠黏膜下层与骨髓间充质干细胞具有良好的相容性。

组织工程进展与展望

自1987年提出“组织工程”概念以来，无论在基础研究、临床应用方面都取得了显著进展，组织工程皮肤、软骨细胞移植治疗关节软骨缺损已获得美国FDA批准进人市场；组织工程骨、软骨、肌腱、神经等已有部分临床应用成功的报道。从“组织工程”概念发展起来的“再生医学”已被广大科学工作者认同。

“流动的肺泡?”——超声谐振微泡定向增加组织局部供氧的理论研究

目的探讨在超声声场作用下,微泡是否可能有助于更多地向局部输送氧。方法依据菲克第一定律、玻意耳定律及道尔顿气体分压定律,建立超声声场作用下的微泡气体交换方程和计算机模拟程序。结果超声辐照加速了微泡内外的气体交换,促进了微泡内O2的快速向外释放。理论分析说明,在超声声场中,微泡的体积收缩和膨胀将加速其内外气体压力的变化和气体交换。结论在高频率交变压力的作用下,超声将加速平衡微泡与周围组织的O2/CO2分压的差异,有助于向局部输送更多氧。

尿源性干细胞的生物学特性及其应用

Zhang等于2008年首次从尿液中分离出一类具有祖细胞特性的细胞,随后证实这类有祖细胞特性的细胞是干细胞,并命名为尿源性干细胞（urine-derived stem cells,USCs）。USCs是一类增殖能力强,具有多向分化能力,能分化成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞,可取自体细胞用于治疗，无免疫原性，不受伦理限制的细胞。

脱细胞羊膜预防生物衍生肌腱修复鸡屈趾肌腱Ⅱ区缺损修复后的粘连

背景:羊膜有预防肌腱修复后粘连的作用,但存在一定的免疫排斥反应。目的:探讨脱细胞羊膜对生物衍生肌腱修复鸡屈趾深肌腱Ⅱ区缺损修复后肌腱粘连的预防作用。方法:分别以罗曼鸡右爪的第2,3,4趾将实验分成生物衍生肌腱组,生物衍生肌腱+脱细胞羊膜组以及自体肌腱组,建立屈趾深肌腱Ⅱ区1cm缺损模型。以生物衍生肌腱桥接第2,3趾缺损,以自体肌腱桥接第4趾的肌腱缺损,在第3趾的生物衍生肌腱和上下吻合口周围包裹完整的脱细胞羊膜。结果与结论:生物衍生肌腱组与自体肌腱组移植物为外源性愈合,生物衍生肌腱+脱细胞羊膜组羊膜有效地防止了成纤维细胞向修复区域内浸润,形成内源性愈合。肌腱粘连程度生物衍生肌腱+脱细胞羊膜组优于生物衍生肌腱组和自体肌腱组,生物衍生肌腱组和自体肌腱组相似,移植物周围的炎症反应生物衍生肌腱+脱细胞羊膜组>生物衍生肌腱组>自体肌腱组。证实脱细胞羊膜能通过机械性阻挡周围肉芽组织向修复区域内生长而防止外源性愈合造成的肌腱粘连。

成骨细胞、血管内皮细胞复合组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的采用异种骨脱细胞基质（heterogenous bone acellular matrix，HBACM）复合细胞构建组织工程骨并植入动物体内，观察其对骨缺损的修复作用。方法培养与鉴定兔成骨细胞（osteoblast，0B）、血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）以及两种细胞的混合细胞。使用猪肋骨制备HBACM，并分别与0B、VEC以及两种细胞的混合细胞共同培养制备组织工程骨。27只新西兰大白兔随机分为三组，切除兔双前肢桡骨制成骨缺损动物模型，左侧植入HBACM与各组细胞复合培养的组织工程骨，右侧植入HBACM为对照。分别于术后3、6、12周取材，观察骨折愈合情况。结果大体形态观察和X线检查表明，组织工程骨修复骨缺损的速度和程度为：联合培养细胞组〉OB组〉VEC组〉单纯HBACM组。BrdU标记细胞示踪检测结果显示：6周时，HBACM上仍可检测到体外培养的标记细胞，并可见新生软骨形成。常规组织学检查可见12周时组织工程骨与正常骨之间的髓腔再通，骨折愈合。Ⅰ型胶原免疫组化研究发现三组均表达Ⅰ型胶原，VEC组略弱。组织切片图像分析示血管面积联合培养细胞组〉VEC组〉OB组，差异有统计学意义。结论联合培养细胞作为组织工程骨种子细胞可以缩短骨折愈合时间、促进骨缺损的修复。

构建椎间盘组织工程的人骨髓间充质干细胞的分离及三维培养

椎间盘退变(Degenerative disc disease,DDD)是下腰痛的主要原因。当前临床治疗主要目的在于恢复生物力学功能和缓解症状。而椎间盘组织工程的兴起为DDD的治疗提供了新方法,其中干细胞是用于椎间盘组织工程的重要种子细胞。在本实验中,我们研究人骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养的细胞学特性以及在Pellet三维培养体系下构建椎间盘组织工程细胞的可行性。结果提示该方法培养的MSCs具较高的纯度,且体外培养具有较强的增殖能力,短时间内可大量扩增,达到组织工程需要的种子细胞数量要求,且细胞保持未分化状态,具有良好的生物安全性。并能表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖等椎间盘细胞外基质,因此是椎间盘组织工程理想的种子细胞。

组织工程技术治疗萎缩性鼻炎的研究现状与展望

目的综述组织工程技术(种子细胞、支架材料联合生长因子)治疗萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis,ATR)可行性的相关研究进展,为ATR的治疗提供新思路。方法广泛查阅近年国内外ATR相关文献,围绕种子细胞、支架材料以及生长因子三要素,对组织工程技术治疗ATR可行性的相关研究进展进行综述,并提出组织工程技术治疗ATR的未来趋势与方向。结果ATR的发病机制及病因尚不明确,目前各治疗方案疗效尚无法达到满意水平。构建细胞-支架复合体缓释外源性细胞因子体系有望逆转ATR病理变化,促进正常鼻黏膜再生,重构萎缩的鼻甲。近年来,外泌体、3D打印、类器官的研究将推动组织工程技术在ATR治疗中的应用与发展。结论组织工程技术将为解决ATR治疗难题提供新的方案。

bFGF对成骨细胞整合素β1亚单位表达和细胞黏附的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成骨细胞整合素β1亚单位表达的影响,探讨纤维黏连蛋白(FN)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独或联合应用时对成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响。方法:培养成骨细胞,以bFGF(100ng/ml)刺激,接种于FN(10μg/ml)修饰的生物衍生骨支架上,Westernblot检测bFGF对FN受体整合素β1亚单位表达的影响,MTT检测组间细胞黏附效率差异,电镜观察细胞密度与形态。结果:Westernblot检测发现应用bFGF刺激后,成骨细胞整合素β1亚单位表达增强;MTT检测发现单独应用FN与bFGF均可增加细胞在生物衍生骨上的黏附效率(P<0.01),但二者联合应用时,产生的效应进一步增强,二者存在统计学上的交互作用(P<0.01);电镜观察也证明,二者联合应用时细胞密度、铺展效果均优于单独应用。结论:bFGF可以显著增强成骨细胞FN受体整合素β1亚单位的表达,明显提高成骨细胞在FN修饰生物衍生骨支架上的黏附效率,bFGF与FN对于促进成骨细胞的黏附具有交互作用。

一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法研究

目的探讨一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法。方法以猪趾浅屈肌腱为例,将肌腱在常温下横切为1 cm左右的肌腱段,通过双光子荧光显微镜观察组织完整性,行冰冻切片联合特殊Masson染色,观察肌腱二级纤维束及周围腱内膜分布情况。另取肌腱段若干经10%中性甲醛固定4 h,分为5组,采用不同的扫面电镜制样方法:A组,单纯梯度脱水;B组,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;C组,梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;D组,梯度脱水至80%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;E组,梯度脱水至100%,行冰冻切片。各梯度脱水试剂为乙醇配制,梯度脱水终浓度均为100%。冰冻切片厚度均为100μm。经临界点干燥喷金后行体视显微镜和扫描电镜观察。结果双光子二次谐波显微成像观察示肌腱结构完整连续。Masson染色观察示周围腱内膜较薄区域难以辨别独立胶原纤维束。体视显微镜观察示肌腱切片电镜制样后大体完整,三级纤维束的周围腱内膜清晰可见。扫描电镜观察示A、D、E组肌腱组织呈现不同程度的过度收缩,二级纤维束结构无法辨别;B组整体呈现无规律的冰晶空隙,二级纤维束结构难以辨认,胶原纤维排列清晰可见;C组连续完整,二级纤维束及其周围腱内膜、胶原纤维排列均清晰可见。结论扫描电镜的肌腱试样制备,可通过组织固定后经乙醇梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片继续梯度脱水至100%,该方法能清晰观察到肌腱二级纤维束及周围腱内膜的形态。

多孔羟基磷灰石血管化实验研究

目的加速多孔羟基磷灰石血管化,采用复合血管内皮细胞生长因子(VEGF)及内植血管束。方法采用新西兰大白兔为实验对象,将复合VEGF及内植股血管束的多孔羟基磷灰石放在兔的左侧大腿肌群内,不复合VEGF的多孔羟基磷灰石放在对侧进行对照,分别在术后1、2、3个月后处死动物,通过大体观察、墨汁灌注及组织学分析等方法进行观察。结果通过对术后1、2、3个月的观察,多孔羟基磷灰石内单位面积上血管数目增多,但复合血管内皮细胞生长因子和(或)内植血管束的多孔羟基磷灰石的增多在同期较对照组明显。结论复合VEGF及内植血管束能加速多孔羟基磷灰石血血管化。

不同周期的高脂血症大鼠模型的相关指标变化分析

目的探讨不同周期的高脂血症大鼠模型的血脂水平及氧化应激水平,科学地分析其变化规律。方法SD大鼠随机分为对照组(正常饮食饮水)和处理组(正常饮水,给予高脂饲料喂养:基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.2%胆固醇+0.2%胆酸钠),两个组别在分为0、15、30、60和90 d 5个小组,观察记录动物的一般状态,在不同的时间节点处理动物,取血清、检测血脂水平和氧化应激水平,肝称重,计算肝系数,部分肝置于4%多聚甲醛中,进行HE组织病理学染色,部分肝组织匀浆,检测血脂水平。结果模型组动物被毛暗淡无光泽,出现脱毛、行动迟缓的状态;体质量自15 d增长较为明显,肝系数自30 d开始明显增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组30 d和60 d血清中TG和CHO明显的升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但90 d的TG与对照组相比,差异并无统计学意义;处理组自15 d开始血清中MDA升高,SOD明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);T-AOC自30 d开始明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。处理组动物的肝组织自15 d开始,淋巴细胞聚集,肝细胞肿胀变性,细胞核挤向一侧,直到90 d肝索排列紊乱,肝细胞肿胀,发生脂肪变性,胞质内有大小不等的空泡肝血窦受压变形等病理改变。结论高脂血症动物模型成模率较高,但在药物预防和治疗作用的研究与分析中,应考虑到代谢的变化和周期的长短,除了血清指标外,建议增加组织和其他代谢酶活性的检测指标,更科学地分析药物的作用。

脂肪来源干细胞在皮肤瘢痕防治领域的研究进展

目的综述脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在皮肤瘢痕防治领域的研究进展。方法广泛查阅相关文献,对ADSCs预防、治疗皮肤瘢痕形成的体外实验、动物实验及临床研究效果、可能机制以及优化ADSCs效果的生物材料进行综述。结果体外、体内实验及临床研究提示ADSCs参与皮肤创伤愈合全过程,可能通过减轻炎症反应、促进血管新生,调控p38/MAPK、过氧化物酶体增殖物激活受体γ或TGF-β1/Smads等通路抑制(肌)成纤维细胞活性,减少胶原沉积,从而预防、治疗皮肤瘢痕。生物工程材料,如猪脂肪源基质水凝胶、猪小肠黏膜下层细胞外基质以及人工合成的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸盐支架,均有可能进一步提高ADSCs防治皮肤瘢痕形成的效能。结论ADSCs在皮肤瘢痕防治研究中取得了显著进展,但临床应用途径仍待进一步研究。

膀胱组织工程研究进展

膀胱作为储尿排尿器官具有重要的生理功能,许多病理原因导致的膀胱损伤往往需要进行膀胱重建。临床上膀胱重建的金标准是胃肠道代膀胱术,但是胃肠道的结构和功能与膀胱有着本质的区别,导致肠段置换术易产生血尿、排尿困难、结石、肿瘤等并发症。近年来,随着组织工程及再生医学的诞生及发展,为膀胱缺损修复提供了新的思路和技术手段。本文就膀胱组织工程的三个方面--种子细胞、支架材料及生长因子的最新进展进行了综述。

不同类型干细胞在缺血性脑卒中治疗中的应用研究进展

目的总结不同类型干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究进展。方法通过检索PubMed数据库,总结2000年—2020年不同类型干细胞治疗缺血性脑卒中的研究结果。结果干细胞可经脑实质立体定向移植、外周血、鼻腔、脑脊液等途径移植治疗缺血性脑卒中,主要通过旁分泌和细胞替代两种机制发挥治疗作用。目前对于缺血性脑卒中及其常见并发症的治疗研究主要集中在神经干细胞、胚胎干细胞及MSCs,这3类干细胞各有优缺点,集中反映在干细胞迁移能力、存活率和安全性等方面。目前已有部分干细胞疗法完成了阶段性临床试验。结论干细胞移植治疗缺血性脑卒中可行且具有巨大临床价值,但在干细胞类型的选择、移植策略、迁移能力及存活率等方面,仍存在一些问题亟待解决。

体质量对去卵巢大鼠骨密度影响的初步探讨

目的观察大鼠去卵巢后体质量变化对股骨骨密度的影响。方法采用6月龄雌性Wistar大鼠40只,随机分为2组,一组切除双侧卵巢,另一组行假手术。术后监测体质量变化,喂养8周后处死,取股骨检测骨密度(BMD)。结果去卵巢后动物体质量增加明显。去卵巢组阴道细胞学无明显的动情周期,表现为低雌激素状态;子宫横切面积较假手术组显著缩小,且子宫内膜厚度、内膜上皮高度、内膜腺体面积百分比等形态计量指标均小于假手术组(P<0.05)。去卵巢组的BMD、骨矿含量(BMC)均低于假手术组,但差异无统计学意义;大鼠单位体质量的BMC在去卵巢组明显降低(P=0.003)。经多元逐步回归分析,BMC与第8周体质量正相关、体质量差负相关;标化BMC与体质量差负相关。结论成功建立去卵巢后骨质疏松动物模型。去卵巢后大鼠一定体质量的增加可能部分减缓去卵巢所致骨量下降,但过度的体质量增加可能导致单位体质量BMC的下降,引起骨质疏松。

一氧化氮光学生物传感器用于药物活性的考察

目的研制一氧化氮(NO)吸光型生物传感器,并将之用于考察刺激巨噬细胞产生NO药物的活性。方法以A l2O3/S iO2为载体,溶胶凝胶法固定细胞色素C(Cyt C),组装传感池,通过紫外分光光度(UV)法考察该传感池在酸化的细胞培养液中对NO的响应性能。测定含有γ-干扰素(IFN-γ)、脂多糖(LPS)、以及以上述溶液为阳性对照的硫酸海藻多糖、香菇多糖、甘露聚糖肽的细胞培养液中NO含量。结果传感池抗干扰能力强,在酸化的培养液中,NO在20.0μm o l/L^180.0μm o l/L的浓度范围内线性关系良好(r=0.9959),检测限为5.0μm o l/L,日内精密度(RSD)=3.5%,日间RSD=7.9%。三种培养液中的NO含量分别为(12.24±3.39)μm o l/L、(8.51±0.19)μm o l/L、(8.23±0.26)μm o l/L。与传统G riess法比较两种方法差异无统计学意义。结论该传感器法可以对细胞培养液中的NO进行半定量分析,作为药物活性初筛的一种新手段。

一种用于肌腱胶原纤维束及周围腱内膜组分分布形态学观察的快速组织学制片方法研究

目的探讨一种用于观察肌腱胶原纤维束及周围腱内膜形态与组分分布的快速组织学制片方法。方法以猪趾浅屈肌腱组织为例,行冰冻切片,片厚6μm。大体观察切片完整性,HE染色观察组织完整性与冰晶形成情况。然后,将切片分为5组,A组行过碘酸雪夫(Priodic acid-Shiff,PAS)染色,B组行Masson染色,C组行网状纤维染色,D组行Ⅲ型胶原免疫组织化学和免疫荧光染色,E组切片经65℃烘烤10 min后行Masson染色。观察各组肌腱胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。结果大体观察切片连续均匀;HE染色见组织整体结构完整清晰,无冰晶空隙形成,但无法观察到胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。A、B、C组肌腱组织整体单一染色,无法辨认胶原纤维束与周围腱内膜组分分布;D组周围腱内膜单独弱显色,两组分能差异化染色,但对比度不明显;E组胶原纤维束与周围腱内膜差异化染色,两组分清晰可见。结论猪趾浅屈肌腱冰冻切片后,通过65℃烘烤10 min联合Masson染色方法可以快速准确显示胶原纤维束与周围腱内膜组分分布形态学表征。

端粒酶催化亚单位基因启动子调控Hsv—tk/GCV系统对肺癌细胞A549选择性杀伤作用的研究

目的研究人端粒酶催化亚单位（human telomerase catalytic subunit，hTERT）基因启动子调控单纯疱疹胸苷激酶／更昔洛韦（herpes simplex virus-thymidine kinase／ganciclovir，Hsv-tk／GCV）治疗系统对人肺癌细胞株A549的选择体外杀伤作用。方法（1）用脂质体法将hTERT启动子和sv40启动子调控的比基因表达质粒（pGL3-hTp-tk和pGL3-sv40-tk）转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5，用逆转录-PCR方法检测转染细胞中此基因的表达情况；（2）用MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用；（3）用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡和细胞周期的影响。结果（1）转染pGCS-sv40-tk的细胞A549、MRG5和转染pGCS-hTp-tk的A549均有tk mRNA表达，转染pGL3-hTp-tk的MRC-5无tk mRNA表达；（2）GCV对转染pGL3-sv40-tk的细胞A549、MRC-5和转染pGCS—hTp-tk的A549体外增殖均有明显抑制作用，对转染pGL3-hTp-tk的MRG-5无明显抑制作用；（3）转染pGL3-sv40-tk的A549、MRC-5和转染pGL3-hTp-tk的A549细胞，GCV处理后细胞凋亡指数（21．58％、9．35％和23．19％）均显著高于转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞（0．78％和0．55％）及空白对照A549和MRC-5细胞（2．17％和0．60％），转染pGL3-hTp-tk的MRC-5细胞凋亡指数（0．88％）无明显升高。结论hTERT启动子调控Hsv-tk基因可以在肺癌细胞中选择性表达，hTERT调控的Hsv-tk／GCV治疗系统对肺癌细胞体外增殖具有靶向性抑制作用。