小肠黏膜下层复合上皮细胞及成肌细胞构建组织工程食管的初步研究

目的初步探索利用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）作为支架材料，复合食管鳞状上皮细胞与成肌细胞构建组织工程食管的可行性。方法4周龄无胸腺小鼠20只，体重20．0±2．5g，雌雄不限。体外分离、培养人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞，并行5-BrdU标记；制备SIS材料并切割成1cm×lcm大小，在SIS材料同一表面接种两种细胞，待细胞在材料表面贴附后将其植入裸鼠体内深筋膜下，于术后第3天及l、2、3周取材行组织学和抗角蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA）免疫组织化学观察，以了解食管鳞状上皮细胞、成肌细胞在SIS材料上的增殖、分化情况和复合物在裸鼠体内的血管化情况。结果人胚胎食管鳞状上皮细胞、成肌细胞能够渗透、生长于SIS材料中，并形成数层结构。植入体内第3天可见细胞增殖为多层覆盖于材料表面，并分泌大量细胞间基质。第2周时已经形成7～8层细胞，并伴有血管长入。3周时细胞增殖为十几层，大量血管长入。通过5-BrdU标记抗体染色观察，示SIS支架材料上生长的细胞多为所植入细胞。抗角蛋白，SMA免疫组织化学染色示移植细胞能够在体内分化。结论成肌细胞与鳞状上皮细胞在SIS材料上的复合培养物，在体内能继续增殖分化形成多层细胞结构，并能快速血管化，可用于组织工程化食管的构建。

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘问充质干细胞（placenta—derived mesenchymal stem cells，PMSCs）和兔骨髓间充质干细胞（bone marrow—derived MSCs，BMSCs）体外分离培养、增殖，对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只，采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只，采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志（CD44、CD105、CD34、CD40L）进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d，每条材料接种（1．0～1．5）×10^6个细胞，苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察，两种细胞均为贴壁生长，形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降，细胞体外培养10代后，生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105，不表达CD34、CD40L。复合培养5d，PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长，大量黏附，细胞积聚成团，相互连接成网状，孔隙内也可见细胞生长和增殖，并分泌基质。扫描电镜观察：复合培养3d，可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附，呈梭形或多角形；8d两种细胞均已大量增长，呈层状排列，细胞连接紧密，分泌大量基质，细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性，可作为组织工程的另一成体干细胞来源。

WO-1生物衍生组织工程骨支架材料的制备及性能研究

目的制备WO-1胶原生物衍生骨复合支架材料,检测其理化性质及力学强度,为骨组织工程研究和应用提供可选择的支架材料。方法将同种异体骨、I型胶原、WO-1进行系列理化处理,制成单纯生物衍生骨材料、胶原生物衍生骨复合材料及WO-1胶原生物衍生骨复合材料。制备后的材料行大体及扫描电镜观察其形貌特征,X线衍射分析材料成分,并对材料的力学性能进行分析测定。结果单纯生物衍生骨材料具有天然骨的网状孔隙系统;胶原生物衍生骨复合材料具有天然骨的网状孔隙系统,微孔表面覆盖胶原膜;WO-1胶原生物衍生组织工程骨复合支架材料具有骨组织的天然网状孔隙系统,微孔表面可见胶原膜覆盖。3种材料的孔径依次为90～700μm、75～600μm、80～600μm;孔隙率依次为87.96%、80.47%、84.29%,差异无统计学意义(P>0.05);其主要成分为羟基磷灰石,弯曲强度和压缩强度无统计学意义(P>0.05)。结论WO-1胶原生物衍生骨复合材料与其它两种材料相同,可作为一种有效的天然组织工程骨支架材料。

成肌分化因子和5-氮杂胞苷联合诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件。方法取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,倒置相差显微镜下观察,细胞布满瓶底即为1代,取第3代MSCs,以5-氮杂胞苷10μmol/L、成肌分化因子0.1ng/ml、转化生长因子β10.1ng/ml、胰岛素样生长因子12ng/ml进行联合诱导,使之分化。诱导后第9天,收集细胞,行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞。结果原代培养的MSCs呈贴壁生长,3～5d呈集落样生长,5～7d后有体积不等的多突成纤维细胞、较大的扁平多角形细胞、中等的多角形细胞和较小的三角形细胞。培养12d后,细胞融合,铺满瓶底,MSCs形态变化不明显。联合诱导后,部分细胞死亡,生长缓慢;7d后见细胞明显增殖,体积逐渐增大,呈椭圆形、梭形或不规则形状;14d后,大量增殖的长梭形细胞开始增多;18～22d后,肌管数量增多,体积增大,核数亦明显增多,初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列,间隔分布。MSCs免疫组织化学法测定CD44反应阳性,胞质呈棕褐颗粒,核周明显,CD34呈阴性反应;诱导后MSCs结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。流式细胞仪测定MSCs和诱导后MSCs大部分处于G0/G1期,分别占79.4%、62.9%,而G2/S/M期仅占20.6%、36.1%。根据MTT绘制生长曲线,可见MSCs生长速度明显高于诱导后的MSCs。两种细胞并未达到平台期,都有继续增殖的趋势。结论在体外,MyoD、5-氮杂胞苷可以诱导MSCs向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达;定向诱导后MSCs增殖期比例大,向骨骼肌细胞分化纯度更高。

细胞治疗对脊髓前角运动神经元保护作用的实验研究

目的研究注射不同的异体细胞于大鼠失神经靶肌肉对脊髓前角运动神经元的保护作用。方法雌性6周龄SD大鼠36只,体重120～150g;随机分为四组,每组9只。无菌条件下切断左侧坐骨神经,一期神经外膜缝合。术后即于小腿三头肌处注射相应细胞,7d注射1次,共4次。A组注射1×106/ml单纯雪旺细胞1ml、B组注射1×106/ml雪旺细胞加成肌细胞1ml(雪旺细胞∶成肌细胞为1∶1)、C组注射1×106/ml混合细胞提取液1ml(雪旺细胞∶成肌细胞∶肾内皮细胞为1∶1∶1)、D组无血清培养液1ml作对照。术后3个月进行脊髓前角运动神经元内C-Jun表达及酶组织化学观察。结果术后3个月,A、B及C组的C-Jun阳性表达脊髓前角运动神经元的形态均较D组好,神经元数目明显多于D组。各组脊髓前角运动神经元内C-Jun活性表达:A组128.591±0.766,B组116.729±0.778,C组100.071±2.017,D组144.648±2.083;D组与A、B及C组比较,差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间及B、C组间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。脊髓前角运动神经元内酶组织化学观察:A、B及C组神经元胞体轮廓清楚,胞体饱满,D组神经元胞体轮廓模糊,胞浆和细胞核界限不清晰。各组脊髓前角运动神经元酶活性比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论雪旺细胞、雪旺细胞加成肌细胞、混合细胞提取液均有保护脊髓前角运动神经元的作用,混合细胞提取液优于雪旺细胞及雪旺细胞加成肌细胞。

低温保存的组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的探讨低温保存的组织工程骨修复骨缺损的能力及低温保存的可行性。方法将人源性生物衍生骨材料复合成骨细胞构建的组织工程骨,在4℃和-196℃的温度环境中保存3个月和6个月,同时以未行低温保存的组织工程骨和生物衍生骨材料作为对照,分别修复实验兔桡骨的长段骨缺损。80只成年日本大耳白兔,随机分为4个实验组(左前肢植入材料):A3组:组织工程骨在4℃保存3个月;A6组:组织工程骨在4℃保存6个月;B3组:组织工程骨在-196℃保存3个月;B6组:组织工程骨在-196℃保存6个月。2个对照组(右前肢植入材料):C组:组织工程骨未行低温保存;D组:单纯生物衍生骨材料。于术后2、4、6和12周行大体和组织学观察,并于6周和12周行X线片检查和生物力学检测。结果术后大体观察,A3、A6、B3、B6和C组间无显著差异,D组骨痂少且断端更为明显。各时间点组织学观察,A3、A6、B3、B6和C组植入材料周围胶原及骨痂均较D组明显,术后12周组织学评分,D组与其它各组比较P值<0.05。X线片示D组植入材料皮质骨无明显变化,骨痂较少;余各组12周植入材料与自体骨融合,髓腔开通,骨折线消失,塑形好。生物力学检测D组与其它各组比较P值<0.05。结论以4℃和-196℃保存方法能有效保存组织工程骨,对修复骨缺损有明显效果,这一方法适宜推广应用。

细胞治疗促进周围神经再生的实验研究

目的研究注射异体不同细胞于大鼠失神经靶肌肉,对神经再生的促进及防止运动终板变性、促进肌肉功能恢复的作用。方法取1周龄SD乳鼠400只,体重20.0±2.3g,制备雪旺细胞、成肌细胞和肾内皮细胞。将SD成年雌性大鼠36只,体重120～150g,随机分为四组,每组9只。无菌条件下切断左侧坐骨神经,一期神经外膜缝合。术后即于小腿三头肌处注射相应细胞,每7天注射1次,共4次。A组注射1×106/ml单纯雪旺细胞1ml,B组注射1×106/ml雪旺细胞加成肌细胞1ml（雪旺细胞∶成肌细胞为1∶1）,C组注射1×106/ml混合细胞提取液1ml（雪旺细胞∶成肌细胞∶肾内皮细胞为1∶1∶1）,D组注射无血清培养液1ml作对照。术后行大体观察,术后3个月取材行靶肌肉的组织形态学观察,行单位面积运动终板个数检测、单位面积靶肌肉Actin阳性肌纤维个数检测,以及酶组织化学观察。于神经缝合口近、远端检测神经鞘细胞密度和再生神经纤维面积的观察。结果术后1~3个月A、B、C组大鼠患肢由不同程度的足踝部溃疡逐渐愈合,肿胀消退,恢复正常行走;D组患侧下肢肌肉萎缩,足踝溃疡、肿胀,足趾挛缩明显,拖行。术后3个月,单位面积靶肌肉运动终板个数、Actin阳性细胞数、失神经肌肉各种酶活性和再生神经的组织学改变,C组优于A、B组（P〈0.01）。A、B、C组实验结果均明显优于D组（P〈0.01）。结论雪旺细胞、雪旺细胞加成肌细胞、混合细胞提取液均有促进神经再生及防止运动终板变性、促进肌肉功能恢复的作用,混合细胞提取液作用优于雪旺细胞及雪旺细胞加成肌细胞移植。

以生物衍生材料为支架的组织工程骨移植早期兔外周血T淋巴细胞亚群的变化

目的检测体外构建的组织工程骨移植后兔外周血T细胞亚群的变化,对移植组织进行组织学观察,探讨以生物衍生材料作为骨组织工程支架材料的可行性。方法组织工程骨以兔骨膜来源的成骨细胞为种子细胞,经抗原自消化、部分脱钙、冻干后的异体骨为支架材料于体外构建。将健康新西兰白兔48只制成1cm长桡骨缺损模型后,随机分成A^D4组,每组12只,分别用部分脱钙冻干骨(partial demineralized freeze-dried bone,PDFDB)、组织工程骨、自体骨、同种异体骨植入兔桡骨节段性缺损。术后1、2、4周取材,用流式细胞仪检测4种材料移植早期兔外周血T淋巴细胞亚群的变化;通过常规组织学检测观察2、4、8、12周时4种材料的成骨作用。结果B组术后2周材料孔隙内有成骨细胞和成软骨细胞,可见骨、软骨混合性新生物形成,周边分布有破骨细胞,部分网架呈蚕食状被破坏吸收。术后4周,形成的新生骨过渡为编织骨。A、B组材料植入后1、2周外周血CD4+和CD8+T细胞较术前明显升高(P<0.05);术后4周CD4+T细胞较术前轻度偏高,但无统计学差异(P>0.05)。C组术后CD4+和CD8+T细胞升高不明显(P>0.05)。D组术后1、2、4周外周血CD4+和CD8+T细胞较术前及其他各组同期均明显增高(P<0.05)。结论PDFDB为支架材料构建的细胞-材料复合物移植后外周血T淋巴细胞增高,但不影响其良好的修复骨缺损能力,生物衍生骨可作为支架材料应用于骨组织工程研究。

WO-1对成骨细胞的生物学效应研究

目的了解WO-1在体外环境中对人成骨细胞增殖、分化的影响,为骨组织工程学研究提供更多的方法. 方法采用培养人胚成骨细胞,以生长曲线和3H-TdR法分析WO-1与成骨细胞生物学效应的量效关系,在最佳作用浓度下,以接种细胞克隆形成率,流式细胞技术分析细胞周期,透射电镜观察细胞形态学,了解WO-1对细胞活性和细胞增殖的影响;以ALP活性检测,3H-Proline掺入实验,放射免疫法测骨钙素合成及I型胶原和骨钙素mRNA的表达等,从蛋白质和mRNA两个水平观察WO-1对细胞功能的影响. 结果 WO-1在高浓度时对人胚成骨细胞增殖有抑制作用,低浓度时对人胚成骨细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度8 μg/ml,在0.25～8 μg/ml浓度范围内存在量效关系.在8 μg/ml WO-1作用下,实验组人胚成骨细胞接种克隆形成率增加,克隆体积增大;群体倍增时间明显缩短,电镜下见细胞器较对照组发达;而ALP活性、Ⅰ型胶原合成、骨钙素合成等,在蛋白质及mRNA两个水平均有增加,且与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论低浓度WO-1,可促进体外培养的人胚成骨细胞活性及增殖,加强细胞合成Ⅰ型胶原、骨钙素等基质的功能,可用作成骨细胞增殖及分化的促进剂.

膀胱平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的实验研究

目的探讨体外快速培养犬膀胱平滑肌细胞的方法及观察膀胱平滑肌细胞在脱细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS上的生长状况,为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供实验依据。方法分别采用酶消化法和组织块培养法分离、获取和原代培养犬膀胱平滑肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。将犬膀胱平滑肌细胞接种到SIS支架材料上,于复合培养5、7及9d取材,行苏木素染色、石蜡切片HE染色和扫描电镜观察膀胱平滑肌细胞在SIS上的生长状况。以细胞-SIS复合培养组为实验组,以膀胱平滑肌细胞为对照组,每组各设9孔,分别于接种后3、5及7d取材,酶消化后收集细胞并计数。结果酶消化法原代培养获取犬膀胱平滑肌细胞数量多,细胞生长速度快,形态良好,培养5d细胞在培养瓶底生长汇合。组织块培养法接种3d见长梭形的膀胱平滑肌细胞从植块边缘萌出,获取的细胞数量较少。透射电镜下见膀胱平滑肌细胞胞质中有特征性细肌丝和细胞膜的密斑。抗α-肌动蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性反应。膀胱平滑肌细胞在SIS表面能黏附、生长和增殖。体外复合培养5d后,膀胱平滑肌细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。7、9d细胞形态与5d相似。实验组3、5及7d的细胞计数分别为(16.85±0.79)×105、(39.74±2.16)×105及(37.15±2.02)×105个,对照组分别为(19.43±0.54)×105、(34.50±1.85)×105及(33.07±1.31)×105个。两组5d细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶消化法原代培养膀胱平滑肌细胞可提供大量活性良好的种子细胞。SIS支持膀胱平滑肌细胞黏附和生长,可为构建组织工程膀胱平滑肌组织提供良好支架。

可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损的组织学及力学研究

目的探讨用藻酸钙凝胶、成骨细胞和骨粉复合构建可塑形组织工程骨修复兔颅骨缺损后,体内成骨的组织学及生物力学特征。方法28只日本大耳白兔,随机分为A组(16只)、B组(8只)和C组(4只)。制备兔颅骨左右两侧直径1cm的骨膜-颅骨全层缺损,左侧用藻酸钙凝胶-成骨细胞-骨粉填补修复为A1组(n=16);右侧用藻酸钙凝胶-骨粉填补修复为A2组(n=16);B组骨缺损不作处理,为空白对照组(n=16);C组为正常组。术后6周和12周时,行大体观察及组织学观察;12周时行生物力学测试。结果术后6、12周时,A1组:颅骨缺损基本被硬组织所修复,镜下见材料已大部分被骨组织替代,成骨面积为40.92%±19.36%;A2组:材料部分被骨组织替代,成骨面积为18.51%±6.01%;B组:颅骨缺损边缘可见硬组织形成,镜下见修复组织以致密纤维组织为主,成骨面积为12.72%±9.46%。术后12周,生物力学测试修复组织能耐受的最大压力载荷,A1组37.33±2.95N;A2组30.59±4.65N;B组29.5±2.05N;C组41.55±2.52N;A1组明显大于A2组和B组(P<0.05)。最大载荷时应变位移,A1组1.05±0.20mm;A2组1.35±0.44mm;B组1.57±0.31mm;C组0.95±0.17mm;A1组小于B组(P<0.05)。载荷/应变比值,A1组35.82±6.48N/mm;A2组24.95±12.40N/mm;B组19.90±5.47N/mm;C组47.57±11.22N/mm;

食管黏膜上皮细胞与SIS复合培养及生物学特性研究

目的探讨体外快速培养犬食管黏膜上皮细胞(esophageal mucosa epithelial cells,EMECs)及其与SIS体外复合培养的方法,为组织工程食管研究提供实验依据。方法取2～5周龄幼犬5只,无菌获取其食管组织,采用混合酶消化法,分离培养EMECs,于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,取第2代细胞培养1～5 d绘制生长曲线并进行细胞表面标志物细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK-19)检测。取第2代EMECs与SIS复合培养4、8 d,行形态学、组织学及扫描电镜观察。结果倒置相差显微镜下EMSCs呈典型铺路石样。CK-19免疫组织化学染色可见细胞胞浆呈阳性染色。MTT法测定第2代细胞在传代培养2 d生长达高峰。EMECs与SIS复合培养4 d,细胞呈多角形,细胞间连接紧密,呈铺路石样排列;SIS表面形成1～2层细胞组成的复层上皮样结构。8 d时,细胞密度增大,SIS表面形成2～3层细胞组成的复层上皮样结构;扫描电镜见细胞在材料上已大量增长,呈层状排列。结论采用混合酶消化法,用含6%FBS的DKSFM培养犬EMECs,方法简便,适合推广应用。SIS与EMECs有良好的相容性,可作为构建组织工程食管的理想支架材料。

成骨细胞与生物衍生支架材料相互作用的基因表达研究

目的研究组织工程骨体外构建过程中,成骨细胞与生物衍生骨相互作用的基因表达。方法用人胚骨膜来源的成骨细胞与生物衍生骨体外复合培养构建组织工程骨。培养2、4、6、8和10d,分别提取总RNA,经逆转录成cDNA。用荧光及TaqMan探针行实时定量PCR,分别扩增成骨细胞特异转录因子(Cbfa1)、成骨细胞特异基因(Osterix)、型胶原、骨钙素(osteocalcin,OC)和整合素α5和β1(Integrinα5andβ1),读取扩增循环数(Ct值),进行统计学分析。以单纯培养的成骨细胞作为对照组。结果Cbfa1与Osterix变化一致,其中实验组Osterix在2d和8d的表达均明显高于对照组(P<0.05)。型胶原与OC的表达变化一致,实验组除10d时,其余各时间段型胶原表达均明显低于对照组(P<0.01)。Intgerin的表达始终处于较高水平,在培养最初的2d,实验组Integrinβ1表达明显高于对照组(P<0.01)。结论成骨细胞与生物衍生材料复合后,重要基因可持续正常表达。作为支架材料,生物衍生骨在保持成骨细胞性状、诱导及促进成骨细胞分化方面有明显优越性;它不仅对细胞顺利进入增殖状态无影响,而且为细胞增殖提供广阔而有效的空间。成骨细胞最终可良好分化,充分发挥成骨功能,并有利于成骨细胞黏附,黏附行为贯穿细胞与材料相互作用的整个过程,而并非局限于开始阶段。

快速培养纯化猪角朊细胞及复合羊膜体外培养实验研究

目的研究快速培养和纯化猪角朊细胞的方法及观察角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况,为组织工程皮肤研究提供实验依据。方法采用加10%胎牛血清的人无血清角朊细胞培养基(definedkeratinocyte-SFM,DKSFM)培养原代猪角朊细胞,分别用DKSFM(A组)、加5%胎牛血清的DKSFM(B组)、加10%胎牛血清的DKSFM(C组)培养传代猪角朊细胞,于接种后1、3、5和7d观察猪角朊细胞的形态及生长曲线。利用猪角朊细胞与培养瓶黏附牢固的特点,用0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)和0.05%胰蛋白酶分步消化,纯化细胞。将第2代猪角朊细胞接种在冻干脱细胞羊膜上,直接苏木素染色、石蜡切片、免疫组织化学染色等方法观察猪角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况。结果采用加10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,细胞生长速度快,形态好,培养5d铺满培养瓶底60%～70%。B组培养的传代猪角朊细胞生长速度较C组培养猪角朊细胞生长速度快。A组培养传代的角朊细胞,细胞生长缓慢。用0.02%EDTA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可获得纯度为95%以上的猪角朊细胞。将第2代猪角朊细胞接种在脱细胞羊膜后12d,可形成单层细胞,呈多角形、铺路石样排列;14d和16d细胞进一步密集,16d细胞出现老化。结论10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,5%胎牛血清的DKSFM培养传代猪角朊细胞,细胞生长速度快。用0.02%EDTA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可以获得高纯度猪角朊细胞。脱细胞羊膜为猪角朊细胞提供良好的支架,接种培养后12d,细胞形态最好。

成骨细胞Cbfa1和Osterix基因在体外构建组织工程骨膜中的表达

目的体外构建组织工程骨膜,研究生物衍生羊膜(humanacellularamnioticmembrane,HAAM)对成骨细胞分化的影响。方法采用人胚骨膜来源的成骨细胞与HAAM体外复合培养构建组织工程骨膜(n=60)。于培养后2、4、6、8和10d,分别提取总RNA,经过逆转录成cDNA,行实时定量PCR,分别扩增成骨细胞特异转录因子(Cbfa1)和成骨细胞特异基因(Osterix),读取扩增循环数(cyclethreshold,Ct)。以单纯培养的成骨细胞作为对照组(n=20)。结果实验组Cbfa1表达以培养后2d和10d最高,且培养后2d与4、6、8d比较,以及培养后10d与4、8d比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组Osterix表达随培养时间延长逐渐升高,培养后8d达最高,与其余各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组Cbfa1和Osterix表达均随培养时间延长逐渐降低。组间各时间点两基因表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成骨细胞与HAAM结合后,Cbfa1和Osterix可持续正常表达。HAAM作为支架材料,可诱导并促进成骨细胞分化。成骨细胞与HAAM构建的组织工程骨膜在分子水平已具有产生骨组织的基础。

两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的初步实验研究

目的比较脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质在修复兔角膜浅层缺损后的机体反应,以寻找适合的组织工程角膜支架。方法新鲜健康人胎盘羊膜按罗静聪等制备方法处理,冻干后消毒备用。牛角膜经0.25%胰蛋白酶消化,生理盐水漂洗后,冻干,消毒备用。雌性日本大耳白兔20只,随机分为A、B组,每组10只。常规麻醉消毒后,采用7.5mm直径环钻造出约1/3角膜厚度的缺损。A组采用复水后的脱细胞冻干羊膜修复;B组采用脱细胞冻干牛角膜基质修复。术后裂隙灯显微镜下观察植片和新生血管状况,并于术后2、4、8周取标本,HE染色,组织学观察。结果术后两组植片无溶解、脱落,于8周降解完全,角膜中央缺损区域大部分恢复透明。两组均有新生血管长入角膜,两组新生血管长入范围比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察2周时两组均有较重的炎性反应,成纤维细胞增生,胶原排列紊乱;4周时炎性反应均减轻,植片区域可以见到新生血管长入;8周时均有较多的成纤维细胞存在,并有少量瘢痕形成。结论脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质修复角膜浅层缺损,仍能引起一定程度的排斥反应,需要进一步的改进。

胎盘和骨髓来源的间充质干细胞生物学特性比较

学术背景:间充质干细胞主要来源于骨髓,但人骨髓中的间充质干细胞含量极低。近年来,已有具备干/祖细胞特征的间充质细胞自外周血、密质骨、软骨、肌肉等组织中分离出来,这些组织的一个共同特征就是来源于胚胎发育期的中胚层,提示胎盘中存在间充质干细胞成分。目的:介绍胎盘和骨髓来源的间充质干细胞的分离方法及应用前景,对其生物学特性进行比较。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1996-01/2008-2的相关文献,检索词"placenta-derived mes-enchymal stem cells,bonemarrow-derived mesenchymal stemcell,Biological characteristics,Tissue engineering",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索万方数据库1999-01/2008-2的相关文献,检索词"胎盘来源的间充质干细胞,骨髓来源的间充质干细胞,生物学特性,组织工程",并限定文章语言种类为中文。共检索到137篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与胎盘来源的间充质干细胞或骨髓来源的间充质干细胞研究以及两者生物学特性比较密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:①重复性研究。②Meta分析。文献评价:文献来源主要是对胎盘和骨髓来源的间充质干细胞研究进展做汇总分析。所选用的31篇文献中,8篇为综述,其余均为临床或基础实验研究。资料综合:①目前对于胎盘间充质干细胞的体外分离以Percoll连续密度梯度分离纯化法最为经典,采用此法从组织浸出液中分离获得的间充质干细胞大小均匀,纯度较高。骨髓间充质干细胞的分离方法主要包括贴壁法、密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法。②胎盘间充质干细胞在形态上与骨髓间充质干细胞类似,均为典型的成纤维细胞样,并呈漩涡状生长。胎盘间充质干细胞表达类似于骨髓间充质干细胞的表面标志,如间质细胞标志SH2/CD105、SH3;主要组织相容性复合物HLA-ABC;整合蛋白家族CD49e、CD29;透明质酸盐受体CD44等,不表达造血细胞表面标志CD34、CD45和内皮细胞表面标志vWF、Flk21等,表明胎盘来源的间充质干细胞免疫原性很低,这在移植中具有重要意义。结论:胎盘来源的间充质干细胞具有与骨髓来源的间充质干细胞相似的形态与表面标志,也具有多向分化潜能,并且胎盘取材方便安全,不涉及伦理问题,将成为组织工程干细胞的新来源。

肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究

目的应用不同来源的成肌细胞(myoblast,Mb)研究肌球蛋白轻链(myosin light chain,Myl)在肌肉再生中的作用,为进一步了解Myl的生理功能提供依据。方法3周龄健康雄性C57BL/6小鼠12只。采用酶消化法和Preplate技术分离纯化小鼠眼外肌、膈肌和腓肠肌Mb(eMb、dMb和gMb),进行传代培养。采用RT-PCR和Western blot法检测第1代细胞Myl的表达,亚甲基蓝法检测细胞增殖能力,倒置相差显微镜观察肌管形成情况。采用浓度为1、2、4、8、16 ng/mL Myl单克隆抗体分别处理3种细胞(实验组),与未处理的细胞比较(对照组),观察细胞增殖能力及肌管形成的变化。结果培养24 h的eMb、dMb和gMb均检测到Myl1、Myl4 mRNA和Myl蛋白表达,且eMb的表达水平显著低于dMb和gMb(P<0.01),dMb和gMb间差异无统计学意义(P>0.05);3种细胞均未检测到Myl2和Myl3 mRNA表达。eMb的增殖速度高于dMb和gMb(P<0.01);eMb和dMb、gMb分别在接种后40 h和16 h出现肌管;第6天eMb肌管数为(137.2±24.5)/视野,显著高于dMb的(47.6±15.5)/视野和gMb的(39.8±5.1)/视野(P<0.01),后两者差异无统计学意义(P>0.05)。Myl抗体作用后,3种细胞实验组各浓度吸光度值均显著高于对照组(P<0.05),表现浓度依赖性;dMb实验组和对照组16 h肌管数分别为(48.2±7.1)/孔和(23.4±4.9)/孔,6 d肌管数分别为(40.6±10.2)/视野和(63.1±6.1)/视野,两组间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论Myl可能通过促使Mb终末分化,负性影响Mb增殖而在肌肉再生中发挥一定作用。

组织工程心肌补片对黑山羊陈旧性心肌梗死心功能和建立侧支循环的影响

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(m arrow m esenchym a l stem ce lls,M SC s)-小肠黏膜下层(sm a llin testina l subm ucosa,S IS)构建的组织工程心肌补片,移植于陈旧性心肌梗死区后对心功能及缺血区建立侧支循环的影响。方法将已建立急性心肌梗死模型后6周的黑山羊16只,随机分为实验组和对照组,实验组抽取自体骨髓,经体外分离M SC s,进行培养、传代,以第3代细胞行5-B rdU标记并与S IS支架材料复合培养5 d,制备M SC s-S IS组织工程心肌补片。将其缝合至陈旧性心肌梗死区;对照组仅行假手术处理。于植入后6周,采用超声心动图观察两组动物心功能变化,数字减影血管造影选择性左冠状动脉造影观察缺血心肌侧支循环的建立。结果术后6周实验组及对照组:心博出量、左心室射血分数分别为42.81±4.91、37.06±4.75 m l和59.20%±5.41%和44.56%±4.23%,组间差异均有统计学意义(P<0.05);左心室舒张末期容积、左室收缩末期容积分别为72.55±8.13、83.31±8.61 m l和29.75±5.98、46.25±6.68 m l,组间差异均有统计学意义(P<0.05);左心室舒张功能各项指标分别为:E峰最大速度分别为54.85±6.35 cm/s和43.14±4.81cm/s(P<0.01);A峰最大速度分别为52.33±6.65 cm/s和56.91±6.34 cm/s(P>0.05)。超声心动图显示对照组左室腔扩张明显,室壁运动明显减弱,梗死区呈瘤样扩张,局部室壁反常运动;实验组左室腔明显小于对照组,室壁运动较对照组强,心尖梗死区扩张不明显。选择性左冠状动脉造影见实验组左冠状动脉前降支远端与回旋支间明显侧支循环建立。结论M SC s-S IS构建的组织工程心肌补片移植于黑山羊陈旧性心肌梗死区后侧支循环建立,心功能有明显改善作用。