移植GDNF基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用

目的：探讨移植胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的神经干细胞（NSCs）是否比单纯NSCs移植对脑卒中有更好的神经保护。方法：用GDNF重组质粒转染NSCs，构建过表达GDNF的NSCs（GDNF／NSCs）。插线法制备大鼠脑缺血卒中模型，再灌注3d，脑立体定位分别移植NSCs、GDNF／NSCs以及生理盐水到同侧侧脑室，实验分为GDNF／NSCs组、NSCs组和对照组。再灌注第1、2、3、5和7周处死大鼠，用改良的神经功能缺失评分和H-E染色分别评估大鼠神经功能和脑梗死体积；免疫组织化学显色观察移植的NSCs数量与分布和突触蛋白Syn、PSD-95在脑组织的表达。结果：再灌注2、3周，GDNF／NSCs组较NSCs组神经功能恢复更好。在各时间点GDNF／NSCs和NSCs组大鼠脑缺血体积较对照组显著减小；GDNF／NSCs组的NSCs细胞数量较NSCs组显著增多。再灌注2和3周，GDNF／NSCs组Syn免疫阳性产物比NSCs组显著增加；各时间点GDNF／NSCs组的PSD-95免疫阳性产物比NSCs组显著增加。结论：GDNF基因修饰的NSCs比NSCs对大鼠脑卒中有更好的神经保护作用。

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。