应用活体内生物发光技术对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981成瘤性和转移性研究

背景与目的应用阳离子脂质体介导的基因转染方法对nm23-H1缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981进行荧光素酶基因(Luc)标记,建立稳定高效表达荧光素酶(Luciferase)基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-Luc。应用活体生物荧光成像技术,非侵入性地连续检测小鼠(裸鼠和SCID鼠)皮下肿瘤模型发展演进、自发转移的过程。方法将带有荧光素酶基因(Luc)的质粒PGL4.17经阳离子脂质体介导转入人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中,筛选出高效稳定表达荧光素酶的细胞株。将转染后的细胞接种于裸鼠和SCID鼠右后腿腹股沟皮下,建立皮下肿瘤模型,利用活体内可见光成像系统观察其在小鼠体内的生长和转移过程。结果转基因人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-Luc可在体内、外持续稳定表达荧光素酶,细胞数和发光值成直线相关。成功地建立了表达荧光素酶活性的动物肿瘤皮下自发转移模型。L9981-Luc保留了原有的高转移特性。瘤重和发光强度呈直线相关。结论利用活体内生物发光技术可以非侵袭性地连续示踪肿瘤细胞在活体内的生长和转移过程,为研究肺癌侵袭转移过程及其机理和最佳治疗策略的选择提供了新的手段和工具。

BAG-1基因在肺癌中的表达及其与预后关系的分析

背景与目的BAG-1是一个与凋亡相关的多功能基因,现有的研究表明BAG-1的表达水平与多种肿瘤的预后相关。本研究旨在探讨BAG-1基因mRNA在肺癌组织中的表达情况及其与肺癌患者的临床病理生理特征和预后的关系。方法采用实时定量PCR方法检测156例肺癌石蜡组织标本中BAG-1基因的转录表达情况,并与其临床病理生理特征相结合进行分析。结果①BAG-1低表达组患者的中位生存时间(33.5个月)明显高于BAG-1高表达组(20.5个月)(P<0.005);②BAG-1低表达组患者的3年生存率为44.74%(34/76)5年生存率为26.32%(20/76),分别明显高于BAG-1高表达组[32.5%(26/80);21.25%(17/80)](P<0.05);两组生存曲线之间比较,BAG-1低表达组患者生存期明显长于高表达组患者(P=0.045);③分层分析发现在Ⅰ期、鳞癌、不伴有转移的肺癌患者中,BAG-1低表达组患者分别较高表达组生存期明显延长,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论BAG-1可用作预测肺癌患者预后的分子标记物,特别是在早期肺癌和鳞癌患者中,BAG-1的高表达可能与患者的不良预后相关。

拓扑替康对鼻咽癌放射增敏的体内实验

目的研究拓扑替康(topotecan,TPT)对鼻咽癌裸鼠移植瘤的放射增敏作用。方法①首先行拓扑替康对裸鼠最大耐受剂量以及拓扑替康和放疗(radiotherapy,RT)有效率的研究;②放射增敏实验方案:53只移植瘤裸鼠随机分为5组,RT 20 Gy组,RT 40 Gy组,TPT12.5mg/kg组,TPT12.5mg/kg+RT20Gy组,生理盐水对照组并给予相应处理,评价有效率(完全缓解+部分缓解)和再生长延缓时间(regrowth delay time,TGD),并绘制生长曲线,计算增敏比,抑瘤率等。结果RT 20 Gy+TPT12.5mg/kg组与RT 20 Gy组和TPT12.5mg组比较差异有统计学意义;RT20 Gy+TPT12.5mg/kg组RT40 Gy组比较差异没有统计学意义;增敏比=1.34。结论本研究证明了TPT对鼻咽癌裸鼠移植瘤放射治疗有明显的增敏效果。

转移抑制基因nm23-H1参与肺癌Ras信号传导机理研究

背景与目的nm23-H1基因已被证实为一种肿瘤转移抑制基因,但其作用机理尚不明了,本研究探讨nm23-H1参与肺癌Ras信号传导的机理。方法应用脂质体法将pEGFP-nm23-H1野生型和突变型质粒(WT,H118F,S120G,P96S,S44A)转染人大细胞肺癌细胞株L9981,采用免疫共沉淀与Western blot方法检测野生型和突变型nm23-H1蛋白与Ras支架蛋白KSR的关系。结果在转染了野生型和突变型质粒的五个细胞株中,鼠抗nm23-H1免疫沉淀物在86KDa处可检测到KSR的阳性条带,而各组KSR的量应用单因素方差分析比较无显著性差异(F=0.190,P=0.938)。结论本研究结果表明nm23-H1与KSR存在相互作用,但这种相互作用与nm23-H1有无突变及突变位点无关,nm23-H1可能是通过KSR参与肺癌Ras信号传导的。

Raf与肺癌的研究进展

二十多年前Raf作为一种独特的癌基因被发现，此后人们对其进行了大量研究，并确立了其在Ras—Raf-MEK—ERK经典信号转导通路中的地位。Ras—Raf-MEK—ERK通路是参与调节细胞增生、分化和凋亡等生物学过程的一条重要的信号转导通路，其与肿瘤的发生关系密切。而Raf，作为这一信号转导通路中的关键分子，对于该通路的信号转导具有决定性作用。关于Ras在肺癌发生中的作用已经进行了大量深入的研究，近年来关于Raf激酶在肺癌发生及治疗中作用的研究也取得了一定进展，本文对此进行着重论述。

人肺癌EGFR基因突变与Gefitinib耐药相关性研究

背景与目的以人肺癌细胞株PC9及其耐药子系细胞PC9/AB2、PC9/AB11、PC9/BB4为模型,观察4株细胞对Gefitinib的耐药差异及耐药机制。方法体外培养细胞测定耐药指数,对4株细胞EGFR基因exon18-21进行测序并在mRNA水平上的测定表达量差异。结果PC9及其3株耐药子系细胞均存在耐药性差异。PC9及其3株耐药子系细胞均存在19外显子15bp缺失突变并且耐药细胞株PC9/AB11外显子20存在A→G的点突变。敏感细胞株PC9的EGFR基因在mRNA水平上的表达量明显高于其他3株耐药株。结论PC9、PC9/AB2、PC9/AB11和PC9/BB4肺癌细胞株对Gefitinib的耐药性存在非常显著的差异,4株肺癌细胞株EGFR基因突变和mRNA表达水平的差异与其与Gefitinib获得性耐药有关。

硒化合物诱导人高转移大细胞肺癌L9981产生活性氧变化的研究

背景与目的已有研究表明甲基硒酸具有防癌和抗癌作用。本研究拟探讨甲基硒酸及亚硒酸钠在人高转移大细胞肺癌L9981的代谢过程中是否产生活性氧及其变化,进一步明确氧化应激在不同硒化合物中发挥抗癌效应的地位。方法应用细胞活力计数仪,检测硒化合物对L9981的生长抑制影响;采用活性氧荧光探针羧基-H2DCFDA探测经硒化合物诱导的L9981细胞内活性氧的含量;采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)与硒化合物同时处理L9981细胞后,流式细胞术检测细胞内活性氧的变化。结果①2.5μMMSA即可明显抑制L9981细胞生长,且随浓度增加,效应增强。②甲基硒酸及亚硒酸钠均可诱导L9981产生显著的ROS变化,亚硒酸钠产生时间早于MSA;③采用NAC同时处理L9981后,甲基硒酸能够显著的促进细胞产生活性氧,而亚硒酸钠能够显著的抑制细胞内活性氧的产生。结论①甲基硒酸及亚硒酸钠对L9981均具有抑制生长的作用,并且具有剂量依赖性;②氧化应激反应参与了MSA及亚硒酸钠诱导L9981细胞死亡的过程。

利用单核苷酸多态性芯片全基因组检测人大细胞肺癌细胞株的杂合性缺失和拷贝数变异

背景和目的DNA序列的杂合性缺失(LOH)和拷贝数变异(CNV)普遍存在于肿瘤基因组,并认为与肿瘤发生发展相关。高密度单核苷酸多态性(SNP)芯片能够检测全基因组的LOH和CNV适用于研究肿瘤遗传变异。本研究运用该技术寻找人大细胞肺癌细胞株NL9980全基因组的LOH和CNV。方法提取细胞株总DNA并应用500K SNP芯片进行检测。芯片获得的500000位点的杂交信号强度数据使用Affymetrix专利软件估算各SNP位点基因型和拷贝数。进一步分析获得NL9980全基因组LOH和CNV。结果芯片的SNP位点检测率超过了93%的主要质控标准。NL9980细胞中LOH散布在所有染色体,CNV主要分布在2,3,4,5,7,10,11和18号等染色体。结论研究表明NL9980基因组存在复杂的遗传变异。SNP芯片高分辨率和提供等位基因型信息等优势极大地提高了肺癌遗传变异研究的能力。

拓扑替康对鼻咽癌放射增敏机制的研究

目的:研究拓扑替康(TPT)对人鼻咽癌裸鼠移植瘤放射增敏的机制。方法:把放射增敏实验各组[RT+TPT组(增敏组),TPT组(药物组),RT组(放射组),生理盐水组(对照组) ]肿瘤标本制备成单细胞悬液,用流式细胞仪分析细胞周期,凋亡指数以及凋亡相关基因p53、bcl 2、bax的表达。结果:增敏组增殖指数 ( 19. 3±1. 7 )%降低,凋亡指数增加,和药物组(25. 2±0. 3)%,放射组 (26. 1±0. 3)%,对照组 (35. 7±2. 5)%比较有统计学意义;p53,bcl 2,bax的表达,各处理组与对照组比较,差异均没有统计学意义。结论:改变细胞周期,促进凋亡可能是拓扑替康增敏作用在细胞水平的重要机制,但诱导凋亡可能不依赖p53,bcl 2,bax基因。

野生型和突变型nm23-H1基因原核表达载体的构建、表达及纯化

背景与目的nm23-H1基因是一个肿瘤转移抑制基因,但关于nm23-H1基因抑制肿瘤转移的生化机理目前并不清楚。该实验目的就是构建nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法通过PCR方法扩增野生型和突变型nm23-H1目的片断,利用基因重组技术构建pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,鉴定正确克隆转化BL21(DE3)溶源菌,进行蛋白表达及可溶性分析,同时采用镍柱亲和层析法进行纯化,应用Western blot方法对纯化后蛋白进行鉴定检测。结果通过酶切和测序鉴定,pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体序列正确,编码框正确。转化溶源菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,且均为可溶性蛋白,Western blot检测结果提示野生型和突变型nm23-H1蛋白分子量为20kDa,与预计值相符。结论成功构建pET28a-nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,所表达蛋白可用于下一步实验研究。

Raf全长及氨基端、羧基端真核表达载体的构建和表达

背景与目的Raf是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路中的关键分子,在多种人类肿瘤中存在高度活化,然而其生物学功能和详细调节机理目前尚未完全明了。本研究旨在构建人Raf基因全长(Raf-1),氨基端(N-Raf)及羧基端(C-Raf)真核表达载体,并观察其在293T细胞中的表达情况。方法通过PCR方法扩增Raf-1,N-Raf和C-Raf目的片段,利用基因重组技术构建pCMV-Tag2b-Raf-1,pCMV-Tag2b-N-Raf和pCMV-Tag2b-C-Raf真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,Western blot检测目的蛋白的表达。结果酶切和测序结果均证实pCMV-Tag2b-Raf-1,pCMV-Tag2b-N-Raf和pCMV-Tag2b-C-Raf真核表达载体的序列和编码框均正确无误,转染后的293T细胞经Western Blot检测可正确表达目的蛋白。结论本研究成功构建了pCMV-Tag2b-Raf-1,pCMV-Tag2b-N-Raf和pCMV-Tag2b-C-Raf真核表达载体并可在293T细胞中表达,为今后进一步研究Raf基因的生物学机理奠定了基础。