反义血管内皮细胞生长因子_(165)基因治疗皮肤恶性黑色素瘤的实验研究

目的研究腺病毒介导的反义血管内皮细胞生长因子165(Adenovirus-mediatedaversevascularendothelialgrowthfactor165,Ad-aVEGF165)基因转染对恶性黑色素瘤体内外生长的影响。方法选用感染复数为100的腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Adenovirus-mediatedgreenfluorescentprotein,Ad-GFP)和Ad-aVEGF165转染人血管内皮细胞株304(endotheliumcellofvessel304,ECV304)和人恶性黑色素细胞(A375)。ECV304细胞分为3组:A375母系组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组。A375细胞分为3组:1640组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组。测定其生长曲线、细胞周期和VEGF基因的表达。于裸鼠皮下接种A375细胞,待成瘤后进行转种和治疗,根据瘤体内注射物的不同随机分为PBS组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组,每组5只;治疗结束后行大体观察、HE染色观察和微血管密度(micro-vasculardensity,MVD)检测。结果A375母系组和Ad-GFP组上清液均能刺激ECV304细胞的生长,Ad-aVEGF165组上清液能抑制ECV304细胞的生长。A375细胞中3组细胞均呈增殖趋势,各时间点的增殖速度比较无统计学意义(P>0.05)。ECV304细胞Ad-aVEGF165组增殖指数降低(P<0.05),A375细胞3组细胞增殖指数比较无统计学意义(P>0.05)。A375细胞1640组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组平均灰度值分别为234.41±13.80、222.73±3.67和180.84±6.34。转种后2周Ad-aVEGF165组裸鼠体内肿瘤体积比Ad-GFP组和PBS组明显减小,并随时间延长越来越明显。HE染色Ad-aVEGF165组有凝固性坏死。PBS组、Ad-GFP组、Ad-aVEGF165组的MVD值分别为65±10、52±11和30±6个/视野。结论在体外,Ad-VEGF165通过抑制A375细胞VEGF基因的表达,进而抑制ECV304细胞的生长。在体内,Ad-aVEGF165阻断肿瘤血管的生成,进而抑制人恶性黑色素瘤的生长。

蓝光对人视网膜色素上皮细胞线粒体膜电位及细胞色素C的影响

目的 探讨蓝光导致人视网膜色素上皮 (retinal pigm ent epithelium,RPE)细胞损伤的分子机制 ,明确在此过程中线粒体膜电位及细胞色素 C(cytochrom e C,Cyt C)是否发生变化。方法 用蓝光照射体外培养的人 RPE细胞 ,罗丹明 12 3荧光染料孵育人 RPE细胞 ,流式细胞仪检测线粒体膜电位 (ΔΨm)。分为 3组 ,A组 :不同光照强度 ;B组 :同一光照强度 ,不同光照时间 ;C组 :同一光照强度和光照时间 ,不同细胞培养终止时间。用酶联免疫法测定Cyt C的活性 ;比色测定 Caspase- 3的活性。分为两组 :(2 0 0 0± 5 0 0 ) lx,光照 6 h为 组 ,光照 12 h为 组。结果 A组线粒体膜电位随着光照强度增加 ,呈逐渐下降趋势 ;B组在光照 3h,RPE细胞荧光强度无明显变化 ,当光照 6 h,荧光强度明显下降 ;C组光照后 6 h,荧光强度开始明显下降 ,一直持续到光照后 4 8h。 组和 组光照后 2 4及 36 h,Cyt C的浓度明显升高 ,光照后 2 4 h,后者 Cyt C浓度的升高值明显高于前者。未检测到 Caspase- 3活性变化。结论 蓝光照射导致培养的人 RPE细胞损伤过程与线粒体膜电位降低、细胞色素

高滴度腺病毒介导的绿色荧光蛋白和反义血管内皮生长因子165cDNA的制备

目的:制备高滴度腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒介导的反义血管内皮生长因子165(Ad-aVEGF_(165))cDNA。方法:人胚肾293腺病毒包装细胞转染第3代Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)cDNA后,反复冻融293细胞,提取腺病毒悬液,用氯化铯梯度离心法纯化腺病毒,在荧光显微镜下测定Ad-GFP的滴度,用空斑法测定Ad-aVEGF_(165)cDNA的滴度。结果:获取了实验所需的第4代腺病毒液,Ad-GFP的滴度为9.5×109efu/ml,Ad-aVEGF_(165)cDNA的滴度为1.2×1010pfu/ml。结论:成功制备了高滴度的Ad-GFP和Ad-aVEGF_(165)cDNA。