肌球蛋白轻链在肌肉再生中作用的体外实验研究

目的应用不同来源的成肌细胞(myoblast,Mb)研究肌球蛋白轻链(myosin light chain,Myl)在肌肉再生中的作用,为进一步了解Myl的生理功能提供依据。方法3周龄健康雄性C57BL/6小鼠12只。采用酶消化法和Preplate技术分离纯化小鼠眼外肌、膈肌和腓肠肌Mb(eMb、dMb和gMb),进行传代培养。采用RT-PCR和Western blot法检测第1代细胞Myl的表达,亚甲基蓝法检测细胞增殖能力,倒置相差显微镜观察肌管形成情况。采用浓度为1、2、4、8、16 ng/mL Myl单克隆抗体分别处理3种细胞(实验组),与未处理的细胞比较(对照组),观察细胞增殖能力及肌管形成的变化。结果培养24 h的eMb、dMb和gMb均检测到Myl1、Myl4 mRNA和Myl蛋白表达,且eMb的表达水平显著低于dMb和gMb(P<0.01),dMb和gMb间差异无统计学意义(P>0.05);3种细胞均未检测到Myl2和Myl3 mRNA表达。eMb的增殖速度高于dMb和gMb(P<0.01);eMb和dMb、gMb分别在接种后40 h和16 h出现肌管;第6天eMb肌管数为(137.2±24.5)/视野,显著高于dMb的(47.6±15.5)/视野和gMb的(39.8±5.1)/视野(P<0.01),后两者差异无统计学意义(P>0.05)。Myl抗体作用后,3种细胞实验组各浓度吸光度值均显著高于对照组(P<0.05),表现浓度依赖性;dMb实验组和对照组16 h肌管数分别为(48.2±7.1)/孔和(23.4±4.9)/孔,6 d肌管数分别为(40.6±10.2)/视野和(63.1±6.1)/视野,两组间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论Myl可能通过促使Mb终末分化,负性影响Mb增殖而在肌肉再生中发挥一定作用。

采用UPLC-MS/MS法研究辣薄荷基厚朴酚在不同种属肝微粒体中的代谢特征

目的:建立测定肝微粒体孵育体系中辣薄荷基厚朴酚浓度的方法,并探讨其在不同种属肝微粒体中的代谢特征。方法:分别将辣薄荷基厚朴酚溶解于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)启动的人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒体孵育体系中,置于37℃水浴中进行孵育,分别于孵育的0、2、5、10、15、20、30、45、60 min时用甲醇终止反应,以厚朴酚为内标,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定各孵育体系中辣薄荷基厚朴酚的质量浓度。色谱柱为Acquity UPLC^(TM)CSH C_(18),流动相为0.1%甲酸溶液-甲醇(梯度洗脱),流速为0.3 mL/min,柱温为30℃,进样量为2μL;离子源为电喷雾离子源,以多反应监测模式进行正离子扫描,用于定量分析的离子对分别为m/z 401.2→331.1(辣薄荷基厚朴酚)、m/z 265.1→247.0(内标)。以孵育0 min时辣薄荷基厚朴酚的质量浓度为参照,计算其在不同孵育体系中的药物剩余百分比、体外代谢半衰期(t_(1/2))和固有清除率(CL_(int))。采用化学抑制剂法探讨辣薄荷基厚朴酚的代谢途径;在上述色谱条件下,采用一级全扫描以正离子方式检测,初步分析其体外代谢产物。结果:辣薄荷基厚朴酚质量浓度检测的线性范围为3.91～500.00 ng/mL,定量下限为3.91 ng/mL;日内、日间RSD均小于10%,准确度为87.40%～103.75%,基质效应不影响待测物的测定。辣薄荷基厚朴酚在人、大鼠、小鼠、犬肝微粒体中代谢明显,而在猴肝微粒体中代谢不明显;孵育30 min后,其在各种属肝微粒体的药物剩余百分比趋于稳定。辣薄荷基厚朴酚在人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒体中的t_(1/2)分别为12.07、17.68、17.59、216.56、61.88 min,CL_(int)分别为0.115、0.078、0.079、0.006、0.022 mL/(min·mg)。细胞色素P450(CYP)2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2酶对该化合物代谢的抑制率分别为55.76%、93.94%、96.01%、93.69%、71.81%、23.25%、28.04%。辣薄荷基厚朴酚在人肝微粒体中两个主要代谢产物的准分子离子峰分别为m/z441.2([M+Na]^+)、m/z 337.2([M+H]^+)。结论:本研究建立的UPLC-MS/MS法简便、快速、专属性强,可用于肝微粒体孵育体系中辣薄荷基厚朴酚浓度的测定及药动学的研究。该化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5种肝微粒体中的代谢特征有差异,且其代谢过程可能与CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9等酶有关。

UFLC-MS/MS研究胡椒碱在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性和代谢表型

应用体外肝微粒体孵育体系,考察胡椒碱在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬5个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢的种属差异,确定其在人肝微粒体中的代谢表型。通过UFLC-MS/MS检测方法,测定胡椒碱在各个种属肝微粒体中孵育后的剩余浓度,考察他们的代谢稳定性及体外代谢动力学参数。采用化学抑制法考察胡椒碱在人肝微粒体中的代谢表型。结果表明胡椒碱在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中,半衰期T1/2分别为31. 36、48. 46、138. 60、147. 45、165. 00 min;体外固有清除率CLint分别为0. 0442、0. 0286、0. 0100、0. 0094、0. 0084m L/(m L·mg);在人肝微粒体中,胡椒碱主要被CYP3A4和CYP2C9酶代谢。推测胡椒碱在各种肝微粒体中的代谢均相对较稳定,其中大鼠和人的肝微粒体代谢性质最相近,在后续的实验中可以考虑用大鼠的代谢结果预测人的代谢结果;人肝微粒体中参与胡椒碱代谢的酶主要有CYP3A4和CYP2C9。

海南崖豆藤提取物HN-1不同种属血浆蛋白结合特性研究

目的:采用超滤法,研究海南崖豆藤抗炎活性成分6-methoxy-8,8 dimethy-3-(2,4,5-rimethoxypenyl)4H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-4-one在大鼠,Beagle犬,食蟹猴和人四个种属中的血浆蛋白结合率。方法:采用超滤法结合液相色谱质谱联用(UFLC-MS/MS)检测方法,对HN-1在大鼠,Beagle犬。食蟹猴和人血浆的蛋白结合率进行测定。结果:在0.1,1,5μg·mL^-1质量浓度FHN-1与大鼠血浆的蛋白结合率分別为(98.57±0.55)%、(96.38±0.55)%、(91.06±0.13)%;与Beagle犬血浆的蛋白结合率分別为(99.44±0.28)%、(96.4±0.88)%、(90.42±0.47)%;与食蟹猴血浆的蛋白结合率分别为(99.73±0.38)%、(95.30±0.34)%、(91.53±1.37)%;与健康人血装的蛋白结合率分别为(99.13±0.07)%、(96.30±0.11)%、(92.06±2.06)%。结论:本研究建立的方法简单准确,特异性强。可用于HN-1的血浆蛋白结合率测定:HN-1与各种属血浆蛋白均为高强度结合(>90%),且在已考察范围内,其血装蛋白结合率无明显种属差异。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂F321-2治疗肿瘤的机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂F321-2治疗肿瘤的机制。方法 MTT法测定F321-2对多类肿瘤细胞的抗增殖活性;划痕实验检验F321-2对A2780s细胞的迁移影响;流式细胞术测定F321-2处理Hct116细胞24 h后的周期影响; Western blot检测F321-2作用Hct116细胞后Ac-α-tubulin、 Ac-H3蛋白的表达情况。采用Hct116异种移植和4T1移植小鼠模型评估F321-2的体内抗肿瘤活性,将模型小鼠随机分为溶剂组,伏立诺他(SAHA, 100 mg·kg-1)阳性对照组, F321-2低、高剂量(25、50 mg·kg-1)组,每组7只,每周3次灌胃给药,记录小鼠肿瘤的体积和重量。结果 F321-2对21种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)范围主要在50~200 nmol·L-1内,具有较好的抗增殖活性; 1 000 nmol·L-1F321-2几乎完全抑制A2780s细胞的迁移; F321-2 (200、 1 000、 5 000 nmol·L-1)处理Hct116细胞24 h后, G2/M期的细胞比例随药物浓度增加而逐渐增多(P <0.05), F321-2能阻滞细胞于G2/M期; F321-2能介导Hct116细胞内Ac-H3蛋白水平的上调,且同剂量下比SAHA效果显著(P <0.05); Hct116异种移植和4T1移植小鼠模型分别给药16 d和19 d, F321-2高剂量组肿瘤体积均明显小于溶剂组和SAHA阳性对照组(P <0.01)。结论 F321-2在体内和体外均具有显著的抗肿瘤作用,抗肿瘤活性可能与HDAC标志蛋白Ac-H3表达水平变化有关。

藤黄酸抗肿瘤作用机制及其纳米制剂的研究进展

藤黄酸是从植物藤黄中提取的主要有效活性成分,近年来发现藤黄酸对多种肿瘤有明显疗效,其作用机制较多,作用靶点广泛。但藤黄酸自身仍具有一些缺点,限制了其在临床上的应用。新型纳米技术能够克服藤黄酸的这些缺点,为藤黄酸新制剂的研究与开发提供了一种新方向。文中综述了近5年来国内外有关藤黄酸抗肿瘤机制以及其纳米制剂方面的进展,可为藤黄酸的进一步深入研究提供参考。

UPLC-MS/MS法研究来那度胺在小鼠体内的组织分布

目的建立超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法快速测定小鼠血浆和组织中来那度胺的浓度,并研究其在小鼠体内的组织分布。方法C57BL/6J小鼠腹腔给药后采集不同时间点的血浆及组织进行药代动力学分析。样品选用蛋白沉淀法处理,色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(1. 7μm,2. 1mm×50 mm),流动相为乙腈-0. 3%甲酸水(40∶60),0. 5 mL·min^-1等度洗脱。用电喷雾电离源(ESI)正离子模式、多反应监测(MRM),选择来那度胺m/z260. 0→m/z 149. 1和内标(D3-PM) m/z 494. 2→m/z 326. 1作为监测离子对进行检测。结果来那度胺在0. 98~1000 ng·mL^-1线性关系良好,血浆标准曲线方程为y=9. 18×10^-4x-4. 64×10^-4(r=0. 997 5),基质效应、回收率、精密度、稀释效应、稳定性的RSD均小于15%。给药后,来那度胺在小鼠的肾、血、脾、小肠、肝等组织分布较多,其他组织中的浓度较小,尤其在脑中分布极少。结论该方法简便、准确、灵敏度高,分析时间短,可用于来那度胺在血浆及组织样品中的检测及药代动力学研究。

海南崖豆藤提取物HN-1的体内外代谢研究

应用体外肝微粒体孵育体系,采用超快速液相色谱质谱联用(UFLC-MS/MS)检测方法,研究海南崖豆藤抗炎活性成分6-methoxy-8,8-dimethyl-3-(2,4,5-trimethoxyphenyl)-4H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-4-one(HN-1)在大鼠、小鼠、恒河猴、Beagle犬和人5个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢种属间的差异;采用化学抑制剂法确定其在人肝微粒体中的代谢表型。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS检测方法,通过比较体外孵育0,60 min的样品,初步推断各种属体外代谢产物;比较粪便、尿液、血浆空白和给药后的生物样品,推测HN-1在SD大鼠体内的代谢产物。结果表明HN-1在各种属肝微粒体中的代谢均较为稳定,其中犬与人的肝微粒体代谢性质最相近;在人肝微粒体中主要经CYP1A1,CYP2D6,CYP3A4 3种同工酶催化代谢;初步推测出HN-1在体内体外的代谢产物,其中包括3个体外代谢产物和5个体内代谢产物,研究结果为HN-1进一步的药理药效研究奠定基础。

促血管生成素及其受体TEK在血管形成中的调节作用

促血管生成素(angiopoietins,ANGPT)及其受体TEK是新发现在机体的生理、病理性血管形成中发挥重要调节作用的信息途径。生理情况下,ANGPT1激活TEK受体,促进血管生成、维持血管完整稳定;ANGPT2则竞争性拮抗ANGPT1的作用,当血管内皮生长因子存在时,可促进血管重建,血管内皮生长因子缺乏时,则促进血管退化。肿瘤发生时,ANGPT及TEK受体在肿瘤组织中表达明显增高,特别是ANGPT2特异表达于肿瘤新生血管区,参与肿瘤血管新生的起始及延续过程。阻断ANGPT及TEK信号传导途径可抑制肿瘤生长,有望为肿瘤的临床治疗提供一种新途径。