抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定

目的获得有生物活性的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端(amplifiedinbrestcancer1-Nterminal,AIB1-N)单克隆抗体。方法以谷胱甘肽转硫酶耦联的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端蛋白(GST-AIB1-N)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AIB1-N单克隆抗体,用间接ELISA和Western-blot鉴定其亚类和抗原结合特异性。结果成功筛选出一株稳定分泌抗AIB1-N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类为IgG1,经Western-blot鉴定该McAb特异性高,亲和力强。结论成功制备了抗AIB1-N单克隆抗体,为深入研究AIB1的表达及临床应用提供了有力的工具。

HCC患者GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化状态研究

目的检测人原发性肝癌(HCC)中抑癌基因GSTP1的启动子区CpG岛甲基化的状况,并探讨其在肝癌发生中的作用。方法以已知的GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化阳性的乳腺癌细胞株MCF-7为阳性对照,以11例正常人外周血单核细胞(PBMC)DNA为阴性对照,用甲基化特异性PCR(MSP)的方法对26例肝细胞癌患者的癌、远癌组织中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化的状态进行检测。结果在26例原发性肝癌中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化在癌组织为88%(23/26),在远癌组织中为69%(18/26);而在11例正常人外周血单核细胞均为甲基化阴性。结论抑癌基因GSTP1基因启动子区CpG岛高甲基化可能是肝癌发生早期的分子事件,在人原发性肝癌的发生发展中具有重要的作用。

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体,并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中,构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38,经EcoR单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞,通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果经EcoR单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达,为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。

不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5

目的构建人内皮抑素(humanendostatin,hES)原核表达质粒pET28a/hES并与简化人纤溶酶原饼环区5(predigestedhumanplasminogenkringle5,predhPK-5)在大肠杆菌中实现共表达。方法RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a/hES。在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT/predhPK-5共同转化E.coliBL21(DE3),并诱导表达重组蛋白。同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性。结果成功构建了重组质粒pET28a/hES,其与pGEX-1λT/predh-PK-5的共转化子在双抗生素压力下可以共存,并在E.coliBL21(DE3)中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20%和21%。在双抗性培养基中培养16h及传代120代,共转化子存活率均大于75%,具有较好的稳定性。结论不相容质粒pET28a/hES与pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性。

简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

从正常人肝脏组织中提取总RNA,合理设计引物,利用RT-PCR直接得到简化的hPK-5基因.将该基因克隆至原核表达质粒pGEX-1λT,将此重组载体转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆.用IPTG诱导阳性克隆表达融和蛋白,SDS-PAGE观察表达产物.再通过Western-Blotting鉴定.简化的hPK-5基因的RT-PCR产物为264bp.通过酶切、测序等方法鉴定简化的hPK-5基因正确克隆至原核表达质粒pGEX-1λT中.重组质粒pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中成功地表达出了GST/predhPK-5融合蛋白,并通过免疫学测定,相对分子质量约为3.6×104,与理论值3.58×104相符.目的蛋白表达量占菌体总蛋白的23.6%.

肝癌患者E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨抑癌基因E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌(简称肝癌)发生、发展的关系,及其在肝癌早期诊断中的意义。方法用巢式甲基化特异性PCR对34例肝癌患者的癌组织、距离癌灶边缘>3 cm的远癌组织及10例未发生肝癌的肝硬变患者的肝硬变组织中E-cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。结果 E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化阳性率,在34例肝癌组织中为61.76%(21/34),明显高于远癌组织中的29.41%(10/34),P<0.05;在10例无肝癌的肝硬变组织中为50.00%(5/10),与肝癌组织和远癌组织比较差异均无统计学意义(P>0.05);在4例正常肝组织中均为甲基化阴性。联合检测癌组织E-cadherin基因CpG岛甲基化与血清甲胎蛋白两种分子标志物,肝癌的检出率可达82.35%。结论抑癌基因E-cadherin启动子区CpG岛甲基化可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用,并且可能是早期事件,其在肝癌的临床诊断及治疗中的意义值得进一步深入研究。