心脏营养素-1对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用

目的观察心脏营养素-1(CT-1)是否能促进经诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)诱导的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞,并研究其相关机制。方法自成年大鼠骨髓中分离BMMSCs,分别以普通培养基(A组)、加入含CT-1的培养基(B组)培养、经5-aza诱导后加入普通培养基(C组)及5-aza加入含CT-1的培养基(D组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)的情况。电镜观察分化后细胞的超微结构及实时荧光定量检测α-actin、β-myosin heavy chain(β-MHC)、Nkx2.5、GATA4基因表达。结果C、D组的BMMSCs在培养4周后均形成心肌样细胞形态,并且均表达cTnT;D组BMMSCs分化的心肌样细胞形成了肌管样结构;D组α-actin、β-MHC、Nkx2.5、GATA4基因表达明显高于C组。结论CT-1可能通过对GATA4、Nkx2.5基因表达的调控而促进5-aza诱导的BMMSCs分化为心肌样细胞。

7个mt-SNP的微测序技术检测及群体遗传学研究

目的建立基于SNaPshot Kit的线粒体上7个单核苷酸多态性(SNP)位点快速、准确的检测方法,并利用该方法对四川地区85个汉族男性无关个体进行群体遗传学研究。方法对4216、7028、10398、10400、12308、12705、14766共7个mt-SNP位点进行复合扩增,采用SNaPshot Kit结合毛细管电泳技术对SNP进行检测。结果建立了7个mt-SNP位点的微测序快速检测系统,在四川地区人群中发现10400、12705和10398位点存在变异,共发现有4种单体型。结论复合扩增结合微测序技术能够同时对多个mt-SNP的多态性进行快速、准确的检测,在法医学实践中有一定应用价值。

一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法

目的改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA。方法健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组。传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养箱消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞。余步骤同传统组。结果传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重。而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;A260/280比值在1.8～2.0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因。结论酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法。RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达（RT-PCR）的分析,并且重复性好,可以推广。

TGFβ2基因单核苷酸多态性与扩张型心肌病的相关性研究

目的通过研究转化生长因子β2(TGFβ2)基因单核苷酸多态性与扩张型心肌病(DCM)的相关性,探讨DCM的免疫遗传学发病机制。方法从169例DCM患者(DCM组)和158例健康对照者(对照组)外周血中提取DNA,采用聚合酶链扩增反应-限制性片段长度多态性技术检测中国西南地区汉族人群DCM患者和健康对照者TGFβ2基因一个标签位点(rs6658835)单核苷酸多态性;用χ2检验比较DCM组与对照组之间基因型频率和等位基因频率的统计学差异。结果 DCM组与正常对照组基因型分布均符合Hardy-W e inberg平衡;与正常对照组相比,DCM患者组TGFβ2基因标签位点(rs6658835)GG+AG基因型和G等位基因频率明显增加,差异有统计学意义(分别为79.3%VS 62.7%和51.2%VS 39.6%,均P<0.01)。结论 TGFβ2基因rs6658835位点单核苷酸多态性与中国西南地区汉族人群DCM相关,TGFβ2基因多态性可能在DCM遗传易感性方面具有重要作用。

心肌肌钙蛋白T基因突变与中国成都地区特发性扩张型心肌病的相关性研究

目的研究特发性扩张型心肌病(IDCM)患者心肌肌钙蛋白T基因(TNNT2,AY044273)突变,及其与中国成都地区IDCM患者发病的关系。方法从96例IDCM患者和110例健康对照者外周血中提取DNA,通过聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合DNA测序,分析96例IDCM患者和110例对照者TNNT2基因是否存在Arg131Trp、Arg141Trp、Arg205Leu、ΔLys210和Asp270Asn突变。结果通过以上方法检测未能发现两组样本中TNNT2基因存在上述突变;但在两组中均发现G9005C和C13350T两个多态位点。结论在小样本中国成都地区IDCM患者中,未发现TNNT2基因存在(Arg131Trp,Arg141Trp,Arg205Leu,ΔLys210和Asp270Asn)突变。G9005C和C13350T两个多态位点与成都地区IDCM无明显相关性。

应用蛋白芯片技术筛选肺癌分子标志物

目的:建立肺癌分子标志物的初筛方法和评价体系。方法:收集2例肺癌患者的癌组织和血浆和2例健康志愿者的血浆,采用蛋白芯片技术检测174个细胞因子在癌组织和血浆中的表达;通过TotalLab软件进行光密度分析,比较同一细胞因子在不同临床样本中的表达差异,查阅文献确定差异表达的细胞因子与肺癌的相关性,筛选出值得深入研究的分子标志物。结论:应用蛋白芯片技术筛选出Ang-2、GRO、MIP-1三个细胞因子具有作为肺癌分子标志物的潜力。

乙酰肝素酶调控滋养细胞中细胞因子表达及其对滋养细胞作用的潜在分子机制预测

目的探究过表达滋养细胞中乙酰肝素酶(HPSE)对细胞因子表达的影响,并且初步预测HPSE对滋养细胞作用的潜在分子机制。方法选择早孕期人绒毛膜滋养细胞株HTR8/SVneo为研究对象,并构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入检验组,以及HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入对照组。采用细胞因子抗体芯片半定量检测,对检验组和对照组滋养细胞株中343种细胞因子的变化情况进行检测。应用Image J软件分析和找出差异细胞因子蛋白。采用Western blotting检测2组滋养细胞株中表达水平差异最大的细胞因子AXL受体酪氨酸激酶表达水平,以验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果。通过STRING蛋白数据库构建蛋白相互作用关系网络,并应用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)在线生物信息学分析软件,进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。结果 (1)细胞因子抗体芯片半定量检测结果显示,与对照组滋养细胞株相比,检验组滋养细胞株过表达HPSE后,其细胞因子表达下降,并且检验组与对照组滋养细胞株中细胞因子蛋白表达水平比值<0.666 7的细胞因子,即差异细胞因子共计15种,分别为AXL、细胞间黏附分子(ICAM)1、TEK受体酪氨酸激酶、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)2、基质金属蛋白酶(MMP)9、淋巴细胞激活基因(LAG)3、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)1B、TNFRSF1A、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、TIMP4、人血小板反应蛋白(THBS)1、白细胞介素17受体B(IL17RB)、连接黏附分子样蛋白(AMICA)及C-C类趋化因子16(CCL16)。(2)Western blotting检测结果显示,检验组滋养细胞株中AXL蛋白表达水平明显低于对照组滋养细胞株,并且差异有统计学意义(t=-6.931,P=0.020),这与细胞因子抗体芯片半定量检测结果一致。(3)通过STRING蛋白数据库分析结果发现,HPSE可通过血管内皮生长因子(VEGF)A,肿瘤蛋白p53(TP53)和CD44与MMP9产生关联,而MMP9又可直接或者间接与除LAG3、CCL16和IL17RB之外的其他12种差异细胞因子相关联,从而建立相互作用关系网络图。(4)细胞因子GO功能富集分析结果发现,差异细胞因子主要涉及细胞凋亡负调控和细胞外基质(ECM)分解等41个生物学过程。KEGG信号通路分析结果显示,差异细胞因子主要涉及癌症蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路。结论过表达HPSE可调控滋养细胞中细胞因子的表达,可能通过MMP9参与的癌症蛋白多糖信号通路影响滋养细胞的生物学功能。本研究结果可为后续研究HPSE对滋养细胞相关疾病影响,提供研究方向和研究基础。

IL-23R基因多态性与中国汉族妇女子宫内膜癌的相关性研究

目的探讨IL-23R基因rs11465817、rs10889677多态性位点单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms,SNP)与中国汉族妇女子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测96例中国汉族妇女EC和138例女性正常对照IL-23R基因rs11465817r、s10889677位点多态性。结果①rs11465817、rs10889677位点等位基因、基因型分布频率在EC组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05);②rs11465817位点基因型频率分布差异与临床病理特点无相关性(P>0.05);③分层分析后发现rs10889677位点基因型分布频率在特殊类型癌与对照组比较差异有统计学意义(P=0.014),CC+CA基因型个体发生特殊病理类型EC的风险是AA基因型的2.816倍(95%CI:1.210~6.553);在不同病理类型组间基因型频率分布差异有统计学意义(P=0.014),CC+CA基因型个体发生恶性程度较高的EC是AA基因型的3.107倍(95%CI:1.239~7.794);在有无肌层浸润组间比较基因型频率分布差异有统计学意义(P=0.046),CA+AA变异型发生肌层浸润危险性是CC基因型的5.259(95%CI:1.079~25.630)。结论 IL-23R基因rs11465817位点SNP与EC无明显相关性;rs10889677位点SNP与中国汉族妇女EC发病相关,可能是导致EC表现出不同临床病理特征的遗传因素之一。

白介素23受体基因多态性与扩张型心肌病的相关研究

目的:本文通过研究白介素23受体(IL-23R)基因多态性与扩张型心肌病(DCM)的相关性,探讨DCM患者的免疫遗传学发病机制.方法:采用PCR-RFLP方法测定DCM患者和正常对照者IL-23R基因rs7517847位点的单核苷酸多态性.用卡方检验比较病例组与对照组之间基因型频率和等位基因频率的统计学差异。结果:IL-23R基因rs7517847位点单核苷酸多态基因型和等位基因频率在DCM组与正常对照组之间无差异。结论:本研究未发现IL-23R基因rs7517847位点多态性与DCM相关。

大鼠早期心肌缺血干燥综合征抗原B基因及其蛋白的表达

目的探讨干燥综合征抗原B基因(SSB)及其蛋白在大鼠早期心肌缺血组织中的表达。方法健康SD大鼠随机分为手术组、非手术对照组和假手术组,根据缺血时间分为0min、15min、30min、60min、120min和240min亚组,依据缺血部位将手术组又分为心肌缺血组和心肌非缺血组。手术组每亚组6只大鼠,非手术对照组及假手术组中的每亚组4只。通过实时荧光定量PCR测定每个样本SSB基因的表达水平,运用Western blot和免疫荧光技术检测SSB蛋白的表达。结果 SSB基因表达在急性心肌缺血早期呈下调趋势,心肌缺血120min组SSB mRNA表达降低,与0min组及非手术对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);与心肌缺血0min组相比,SSB蛋白在心肌缺血60min组的组织中的表达降低(P<0.05);心肌缺血60min和120min,SSB蛋白在非缺血组中的表达高于缺血组(P<0.05)。缺血心肌组织中,SSB蛋白主要位于心肌细胞核,胞浆及部分心肌细胞的细胞膜上也有少量表达。结论 SSB在急性心肌缺血后呈现差异性表达,可能参与早期缺血心肌的病理生理过程。

ZASP基因与特发性扩张型心肌病相关性研究

目的探讨成都地区特发性扩张型心肌病(IDCM)人群中是否存在Z带选择性缝接PDZ基序蛋白(ZASP)基因突变以及与该地区IDCM患者的相关性。方法2006年1月至2007年12月在四川大学华西医院采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术(PCR-SSCP)结合DNA测序方法,筛检成都地区无血缘关系汉族人群(包括120例IDCM患者,100名健康对照者)ZASP基因外显子4、6、10的可能突变位点。结果在IDCM组和正常对照组中,ZASP基因外显子4、6单链构象多态性(SSCP)电泳图谱未发现差异;但外显子10SSCP电泳图谱发现差异,经DNA测序证实为G216T杂合子与T216T纯合子。G216T杂合子在IDCM组检出28例,对照组检出12例;T216T纯合子在IDCM组检出9例,对照组检出4例。G/T基因型及T等位基因频率在IDCM组和对照组中差异有统计学意义(P<0.05)。结论ZASP基因外显子10G216-T多态性与成都地区汉族IDCM患者遗传易感性相关;提示T等位基因为扩张型心肌病的易感基因。

长期发热Angelman综合征患儿临床特点并文献分析

目的探讨1例伴2次长期发热的Angelman综合征(AS)患儿的临床特点,并结合相关文献进行分析。方法选择2013年9月,因"发热3^+个月,抽搐5次"于四川大学华西第二医院就诊的1例居住藏区的9个月龄汉族女性AS患儿为研究对象。回顾性分析其临床病历资料,并检索建库至2015年8月,维普、中国知网、万方及PubMed数据库中关于AS伴发热的相关文献进行分析。结果①病史采集结果:本例患儿2次长期发热,分别于6个月龄时持续发热8个月,18个月龄时持续发热2个月,发热前均有明确呼吸道感染诱因,抗感染治疗后仍发热。患儿有频繁无意义笑容,伴语言发育落后、头部控制差、双目不能追物,以及手、足有较多不自主运动等精神及运动发育落后,反复抽搐发作及脑电图异常,染色体微阵列分析显示15q11.2-q13.1缺失,甲基化检查基因分析结果为母源性15q11-13缺失。对其随访观察3年,期间给予抗癫痫治疗,移居到低温(14℃)或低压(氧)地区(海拔2 100m)可短时间内缓解其发热,抽搐发作及精神、运动发育落后随体温下降而好转。②文献检索结果:在本研究检索条件下,共检索到10篇AS伴发热相关文献,仅其中2篇文献报道了3例长期发热AS患儿,长期发热次数均为1次。结论长期发热的AS患儿体温,可能受低温及低氧环境影响而下降,其抽搐发作及精神、运动发育落后临床的表现,随体温正常而好转。

肺结核患者生命质量的影响因素

目的了解肺结核患者的生命质量,分析其影响因素,为提高患者生命质量提出建议。方法用分层整群抽样方法,抽取2015年5月至12月昆明市3县区在治肺结核患者共392例,应用量表QLICD-PT(V2.0)和社会支持评定量表(SSRS)测量患者的生命质量和社会支持水平,用多重线性回归分析法分析生命质量影响因素。结果肺结核患者生命质量总得分为168.53±22.40,初治患者得分高于复治患者(P=0.034,差异有统计学意义);多重线性回归分析显示社会支持水平高(P=0.016,差异有统计学意义)、家庭经济收入高(P=0.028,差异有统计学意义)、常锻炼(P=0.002,差异有统计学意义)的患者生命质量高;白细胞数高于正常值范围的患者(P=0.022,差异有统计学意义)、女性患者(P=0.004,差异有统计学意义)生命质量低。结论提高患者社会支持水平,控制感染,给予经济支持,鼓励患者经常锻炼身体,关注复治患者、女性患者,从而提高肺结核患者生命质量。

Toll样受体mRNA在不同类型甲状腺疾病组织中的表达

目的:本研究旨在从转录水平分析TLRs在不同类型甲状腺疾病组织中的表达差异。方法:收集临床甲状腺切除术的不同类型疾病患者的组织样本共55例,制备总RNA、行逆转录反应及PCR扩增TLRs mRNA。结果:研究发现TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7在所有样本中都有表达,TLR5、TLR8、TLR9在HT组织中阳性表达率分别是66.67%、50%、0%,TLR9在结甲肿组织中的阳性表达率为30%,TLR9在PTC组织中的阳性表达率为40%;在同一疾病组及周围正常组织之间,TLR1-TLR10转录水平表达率无显著差异(P>0.05),疾病组之间表达差异不显著(P>0.05)。结论:本研究结果为进一步研究TLRs在甲状腺疾病发病机制中的作用提供了实验依据。

子痫前期孕妇胎盘组织中circRNA表达谱及circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络分析

目的通过高通量测序鉴定子痫前期(PE)孕妇胎盘组织中环状RNA(circRNA)的表达谱,构建circRNA-微小RNA(miRNA)-信使RNA(mRNA)相互作用网络,揭示PE发病的相关通路及调控机制。方法收集2019年11月至2021年6月在四川大学华西第二医院分娩的42例PE孕妇(PE组)和30例正常妊娠孕妇(对照组)的临床资料并采集其胎盘组织。(1)采用高通量测序技术建立其中5对PE组和对照组孕妇胎盘组织中的差异表达circRNA谱。(2)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证其中6个差异表达circRNA在PE组和对照组胎盘组织中的表达水平。(3)使用生物信息学方法预测靶miRNA和分析共表达mRNA,构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络;并对差异表达circRNA进行基因本体(GO)功能注释分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。(4)采用logistic回归分析、Pearson相关、Kendall tau-b相关分析检验3个差异表达circRNA与PE发生风险、临床特征的相关性。(5)选择circRNA_05393进行后续功能研究,使用小分子干扰RNA、过表达质粒分别敲低或提高滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞中circRNA_05393的表达水平,采用穿膜小室(transwell小室)体外实验检测细胞的迁移、侵袭能力,活细胞计数法检测细胞的增殖能力,细胞成管实验检测细胞的成管能力。结果(1)高通量测序发现了72个差异表达circRNA,其中35个上调,37个下调。(2)qRT-PCR技术检测显示,与对照组比较,PE组孕妇胎盘组织中circRNA_00673(分别为1.306±0.168、2.059±0.242;t=2.356,P=0.021)和circRNA_07796(分别为1.275±0.232、1.954±0.230;t=2.018,P=0.047)的表达水平显著升高,而circRNA_05393(分别为1.846±0.377、0.790±0.094;t=3.138,P=0.002)的表达水平显著降低。(3)circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络中包含3个circRNA、8个miRNA和53个mRNA。GO分析显示,生物过程方面主要富集于铁离子稳态、动作电位膜去极化和神经元动作电位等通路,细胞组分方面主要富集于皮质细胞骨架,质膜成分等,分子功能方面主要富集于电压门控钠通道活性、碱性氨基酸跨膜转运蛋白活性等。KEGG信号通路富集分析显示,相互作用网络中的mRNA主要富集于补体和凝血级联反应、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,p53信号通路,过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路。(4)logistic回归分析结果显示,circRNA_05393表达下调是PE发生的危险因素(OR=0.044,95%CI为0.003~0.596;P=0.019);相关性分析结果显示,circRNA_05393与PE孕妇的收缩压、舒张压显著相关(P均<0.05)。(5)敲低或过表达circRNA_05393显著降低或增加HTR-8/SVneo细胞的迁移、侵袭能力(P均<0.05),但对细胞成管能力、增殖能力无显著影响(P均>0.05)。结论胎盘组织中circRNA表达谱的构建、circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络的探索为揭示特定circRNA在PE发生中参与的调控机制提供了可能。抑制circRNA_05393可能通过减少滋养细胞的迁移和侵袭来参与PE的进展。

TLRs表达和HPV16感染与宫颈鳞癌的相关性研究

目的分析Toll样受体(TLRs)mRNA在宫颈鳞癌和宫颈炎组织中的表达差异及与HPV16感染之间的关系,为研究TLRs在宫颈鳞癌发生发展中的作用提供依据。方法以RT-PCR方法检测80例临床组织样本中HPV16 E6和E7的表达及TLRs mRNA的表达,分析各组表达率的差异。结果未发现鳞癌组和宫颈炎组HPV16感染与TLRs mRNA表达具有相关性;鳞癌中TLR3 mRNA表达率低于宫颈炎组(P<0.05);TLRs mRNA在中分化与低分化鳞癌中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TLR3mRNA可能与宫颈鳞癌的发病机制有关,TLRs mRNA和HPV16在宫颈鳞癌中的表达未见相关性。