前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础，拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT—PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS；克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack—CMV上，形成含目的基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack—CMV—bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组，获得重组pAdEasy—CMV—bimS，线性化后脂质体法转染人胚肾（HEK）293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察；将病毒以MOI-100感染HEK293细胞，western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48～72h观察到GFP表达，7d出现典型细胞病变症状（CPE）；提取培养上清中病毒DNA，以PCR法可检测到bimS的扩增产物；western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白，与未感染的阴性对照细胞相比，bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功；为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。