甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。

应用抑制消减杂交研究惊恐致肾虚及金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因(英文)

背景:中药金匮肾气丸能改善肾虚症状,但其分子机制还不清楚。目的:用抑制消减杂交技术观察惊恐致肾虚及中药金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因。设计:随机对照动物实验。单位:成都中医药大学中医遗传学研究室,四川大学生命科学学院分子生物学与生物技术四川省重点实验室。材料:实验在成都中医药大学实验动物中心进行。取BALB/c雄性成年小鼠30只,单纯随机分为模型组、药物治疗组和对照组3组,每组10只小鼠。方法:模型组和药物治疗组小鼠应用“恐伤肾”法和悬吊应激法制备肾虚鼠模型。药物治疗组小鼠每天灌服金匮肾气丸(北京同仁堂制药厂生产,由桂枝、附子、熟地、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、丹皮等组成)1次,给药剂量按成人用药量的20倍。造模及给药时间总共为14d。对照组小鼠自然生长,不施加任何外界刺激。最后一次给药后24h,3组小鼠均取血100μL,应用SMART技术反转录并扩增以获取各组小鼠血液的全长总cDNA;运用正向和反向抑制消减杂交技术获得正反两个方向、3种状态下(肾虚、治疗后以及正常生理状态)的6组差异表达cDNA片段。主要观察指标:金匮肾气丸对肾虚小鼠基因表达的影响。结果:①各组均有差异表达的cDNA片段;中药治疗后,肾虚小鼠的差异基因表达谱有向正常生理状态下接近的趋势;用同一种cDNA作为抑制消减杂交的tester和driver,同源片段全部被消减掉,消减效率较高。②获得了6个cDNA文库。结论:惊恐所致肾虚与一些基因的差异表达相关,而中药金匮肾气丸能影响这种改变,使其差异表达基因谱趋近于正常生理状态。

用抑制消减杂交技术研究惊恐致肾虚小鼠差异表达基因

目的 用抑制消减杂交技术研究惊恐致肾虚及中药金匮肾气丸治疗后小鼠的差异表达基因。方法 实验分模型组、治疗组和对照组 ,通过“猫吓鼠”法与“水面悬吊应激”法相结合建立小鼠肾虚证动物模型 ,对治疗组小鼠进行中药金匮肾气丸的治疗。应用SMART(SwitchMechanismAt 5endofRNATemplate)技术逆转录并扩增以获取造模及治疗前后小鼠血液的全长总cDNA ;运用正向和反向抑制消减杂交技术获得正反 2个方向、3种状态下 (肾虚、治疗后以及正常生理状态 )的 6组差异表达cDNA片段 ,进而获得了 6个cDNA文库。结果 获得 6个cDNA文库 ,为大规模鉴定、筛选靶基因奠定了基础。结论 惊恐所致肾虚与一些基因的差异表达相关 ,而中药金匮肾气丸能影响这种改变 ,使其差异表达基因谱趋近于正常生理状态。