共表达猪IL-4/6与抗菌肽融合基因的重组酵母菌的生物活性及其对小鼠免疫增强作用研究

为开发高效安全经济的免疫调节剂,本研究构建了共表达猪IL-4/6和猪抗菌肽融合基因VRP的重组毕赤酵母SG46P。通过猪淋巴细胞增殖试验和抑菌试验检测其发酵上清液的生物学活性和抑菌活性,并用该重组毕赤酵母对30只21日龄雌性ICR小鼠进行灌胃接种。接种后,每周采集小鼠尾部静脉血进行免疫功能分析试验;并在第28 d用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行小鼠腹腔攻毒试验。结果显示:实验组SG46P的发酵上清液较对照组能显著刺激猪淋巴细胞的增殖(p<0.05),且该发酵上清液具有明显的抑菌作用(p<0.05)。接种重组毕赤酵母SG46P的小鼠的体质量有所增加(p>0.05)且其外周血中白细胞数量、血红蛋白含量均显著高于对照组(p<0.05);其血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平均较对照组显著增加(p<0.05),其外周血中CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量均显著高于对照组(p<0.05);TLR4、TLR9、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、CD62L、IL-7、IL-23、CAMP和Crp4基因的转录水平均显著高于对照组(p<0.05)。攻毒后,接种SG46P的小鼠的生存率显著高于对照组(p<0.05)。结果表明:重组毕赤酵母SG46P不仅能够显著提高小鼠免疫基因的转录水平,有效提高动物的先天和获得性免疫水平,还可明显增强小鼠抗感染能力,这为研制高效安全经济的分子免疫调节剂和防治动物传染病开拓了新途径。

β-内啡肽基因在小鼠体内表达的生物效应研究

本研究采用壳聚糖及其改性分子离子交联法包裹制备β-内啡肽基因重组质粒纳米颗粒,然后肌肉注射小鼠,另设口服重组酵母菌组,研究β-内啡肽基因在小鼠体内表达的生物效应。结果发现:肌注质粒与口服酵母菌均可促进小鼠生长,增加小鼠体重;外周血中CD4^+T、CD8^+T细胞数量以及小鼠血清Ig G含量均显著提高(P<0.05),免疫相关基因的相对表达量也都显著提高(P<0.05);试验组小鼠血清中的β-内啡肽含量较对照组明显增加(P<0.05)。表明β-内啡肽基因重组质粒壳聚糖纳米颗粒能有效调节小鼠免疫反应,增强机体抗应激的能力。

融合抗菌肽基因在重组毕赤酵母的表达及体外活性研究

目的：在毕赤酵母SMD1168中表达融合抗菌肽,并检测其体外抑菌活性。方法：本实验从实验室先前构建的重组质粒pVAX1-RHKJT中克隆出已构建好的融合抗菌肽RHKJT基因片段,将RHKJT基因片段插入至pGAPZaA真核表达质粒中,通过PCR和测序验证,构建pGAPZα-RHKJT重组真核表达质粒,将线性化的pGAPZα-RHKJT电转化至毕赤酵母SMD1168中获得重组酵母SMDp G-RHKJT,并通过PCR和RT-PCR验证,对重组毕赤酵母SMDpG-RHKJT进行发酵,并收集发酵上清液进行体外生物活性测定。结果：成功获得重组酵母SMDpG-RHKJT菌株,重组酵母发酵上清液对大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、沙门氏菌标准菌、金黄色葡萄球菌标准菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、肺炎链球菌标准菌均具有显著的抑菌活性。结论：重组酵母表达的融合抗菌肽具有较广的抗菌谱和较高的抑菌活性,具有良好的潜在应用前景。

猪白细胞介素4/6与牛融合抗菌肽共表达重组毕赤酵母的构建及其对小鼠的免疫协同效应

以2A自剪接技术构建猪白细胞介素4／6与牛融合抗菌肽（FBC）共表达重组毕赤酵母，为研究重组酵母对小鼠体内外的免疫协同效应，首先采用猪淋巴细胞增殖试验和抑菌试验研究重组毕赤酵母的体外生物学活性；再以发酵的重组酵母菌液进行小鼠灌胃试验，在试验的28d用致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行腹腔攻毒，每周采血检测小鼠的生长和免疫功能变化。体外试验结果显示，试验组比对照组显著刺激猪淋巴细胞增殖；明显抑制大肠杆菌标准菌、大肠杆菌耐药菌、金黄色葡萄球菌标准菌和金黄色葡萄球菌耐药菌的生长（P〈0．05）。小鼠灌胃试验结果表明，试验组小鼠外周血的白细胞、Th和Tc细胞含量显著多于对照组；试验组tlrs（tlr-1，4，6，9），il-1，il2，il-4，il-6，il-7，il-15，il-23和cd62l基因的表达明显高于对照组；试验组血清中的IgG、IgGl和IgG2a的含量比对照组显著增加。此外，试验组小鼠的体质量比对照组明显增加。攻毒后试验组80％的小鼠存活，而对照组小鼠则有明显的炎症及临床症状，最后全部死于感染，这表明试验组的存活率显著高于对照组（P〈0．05）。白细胞介素4／6与牛融合抗菌肽共表达重组毕赤酵母能够有效提高小鼠免疫功能，为探索研制增强动物免疫机能的安全高效的免疫调节剂提供新途径。