猪作为供体的异种肝移植的研究与进展

背景:猪易于饲养,易繁殖,器官大小与人较匹配,并且可通过基因调控技术来增强供受体器官匹配性,因此猪是最佳异种供体器官的大动物模型。目的:总结近年来猪作为供体的异种移植研究进展。方法:应用计算机检索PubMed数据库及万方数据库2001-01/2010-12有关以猪及非人类灵长类为供体进行异种移植的文献报道。结果与结论:使用猪作为供体的异种移植应用于临床可能会缓解供体器官短缺的问题,然而异种移植免疫学方面还存在某些障碍,可通过基因工程技术和开发新型免疫抑制剂来解决。至此所进行的研究还不能完全克服免疫排斥反应,并且除免疫因素外,还有异种病原的感染问题,如猪内源性反转录病毒。现在还不能确定是否具有潜在的感染性,随着进一步的研究,将会彻底克服免疫排斥和病毒感染等问题。

人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC杀伤作用初步研究

目的:探讨人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC的结合和杀伤差异,为猪-人异种肾移植临床应用的供体猪血型选择提供理论依据。方法:抽取20例健康正常人、20例终末肾病患者和20例脑死亡器官捐献者血清,并根据ABO血型分成4组(A血型:n=20;B血型:n=17;AB血型:n=7;O血型:n=16)。用流式细胞术检测4组人血清分别与O血型野生型(WT)、α1、3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基因敲除(GTKO/β4GalNT2KO)、β1、4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因敲除(GTKO/CMAHKO)和3种基因敲除(TKO/hCD55)猪外周血单个核细胞(PBMC)和红细胞(RBC)的抗体结合或补体依赖的细胞毒性试验(CDC)。结果:A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体IgM和IgG分别对WT猪PBMC,GTKO猪PBMC,GTKO/β4GalNT2KO猪PBMC,GTKO/CMAHKO猪PBMC,TKO/hCD55猪PBMC的结合和杀伤无明显差异。A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体分别对WT猪RBC,GTKO猪RBC,GTKO/β4GalNT2KO猪RBC,GTKO/CMAHKO猪RBC,TKO/hCD55猪RBC的结合无明显差异。结论:O型血的TKO猪可能是目前最佳基因型供猪,且受者可能不需要考虑血型因素。

脐带间充质干细胞研究现状与临床治疗

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一类起源于中胚层的成体干细胞,可以从骨髓、脂肪、胎盘、脐带血以及脐带中分离出来,具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。1991年McElreavey首次从人脐带华尔通胶（Wharton′sjelly,

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗血液系统恶性肿瘤研究进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)是将不同来源的单个核细胞在体外用多种细胞因子诱导培养后获得的一群异质性免疫细胞,具有增殖活性高、杀瘤活性强、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、杀瘤活性不受环孢素等免疫抑制剂的影响和对正常骨髓造血前体细胞毒性小等优点,已被应用于血液系统恶性肿瘤的临床治疗。本文对CIK细胞在血液系统恶性肿瘤的应用做一综述。

复方仙草颗粒对人肾足细胞保护作用的研究

目的研究复方仙草颗粒对人肾足细胞的保护作用。方法在体外培养人肾足细胞,实验分为4组:阿霉素组、雷公藤甲素组、地塞米松组、复方仙草颗粒组。采用MTT法检测细胞增殖,荧光技术观察细胞骨架的形态变化,Realtime PCR法检测细胞内nephrin、CD2AP mRNA的表达,蛋白质印迹技术观察细胞内nephrin、CD2AP的蛋白表达水平,流式细胞仪观察细胞内ROS水平。结果与阿霉素组相比,复方仙草颗粒组人肾足细胞增殖速度明显增加,且具有一定的量效性和时效性;细胞骨架F-actin排列有序,荧光增强;细胞内ROS水平明显降低,足细胞相关蛋白nephrin和CD2AP表达明显提高。结论复方仙草颗粒通过抑制ROS水平,上调足细胞相关蛋白nephrin和CD2AP的表达,维护细胞骨架,从而对人肾足细胞起到保护作用。

胰腺部分切除诱导胰岛细胞再生小鼠模型的建立及研究

目的探讨小鼠部分胰腺切除手术诱导的糖尿病以及对胰岛细胞再生的影响,以建立研究胰岛细胞再生的动物模型。方法对3月龄近交品系C57B6小鼠胰腺切除65%～70%,通过代谢方法、糖耐量和免疫组织化学的方法,研究该方法对血糖和胰岛细胞的再生影响,以确定该模型是否能用于糖尿病的研究。结果小鼠胰腺部分切除,术后一周内小鼠糖耐量受损。术后第14天和第28天的糖耐量实验结果表明3月龄小鼠的糖耐量随着时间的推移而逐渐恢复。免疫组化结果显示3月龄小鼠术后1周胰岛β细胞再生率为(15.1±10.0)%,2周为(25.4±8.1)%,4周为(45.7±14.6)%。结论胰腺部分切除手术能够一定程度上诱导小鼠产生糖尿病,并且诱导胰岛β细胞的再生,从而可用于研究胰岛β细胞再生的基础研究。

小儿肝移植受体的选择和评估

肝移植是治疗小儿各种终末期肝病唯一有效的手段,经过数十年的发展,肝移植技术在国内外已日趋成熟。由于多种原因,国内小儿肝移植的发展滞后于成人肝移植,并且与成人比较,小儿肝移植有其自身的特点,反映在适应证、供体选择、手术技术难度、术后管理等方面均与成人有明显不同,如原发性胆道疾病和先天性代谢疾病占较大比例。

大鼠腹部异位心脏移植模型建立的操作流程

目的建立大鼠腹部心脏移植模型的标准流程。方法通过建立大量大鼠腹部异位心脏移植模型,归纳总结整个过程中的操作技巧。结果术前的精心准备,术中精心操作、术后加强护理,将明显提高实验的成功率。通过不断总结优化操作流程和手术技巧,模型建立成功率及术后存活率均可达到90%。结论标准化的手术操作过程可促进成功有效的大鼠心脏移植模型的建立,并确保模型的质量及受体的存活率。

小鼠腹腔异位心脏移植模型的建立及注意事项

目的通过建立小鼠腹腔异位心脏移植模型,归纳总结制作流程和注意事项。方法选用雄性昆明鼠60只,行30对腹腔异位心脏移植模型。取供体心脏时,用4℃肝素水从下腔静脉持续灌注冲洗,待肝脏变色后,剪断腹主动脉,再持续冲洗,待流出液变淡后,进入胸腔取供体心脏,移植手术是在10倍显微镜下由单人操作完成,术中将供体小鼠心脏的升主动脉和肺动脉分别与受体小鼠的腹主动脉和下腔静脉进行端侧吻合,手术完毕后,用棉签压迫止血,1min后缓慢放开,将供体心脏置于受体腹右侧。结果共实施手术30例,成功27例,成功率为90%;移植心脏存活>30d;移植心脏5min内复跳,并且活动有力。结论通过不断优化操作流程和手术技巧,保证了小鼠心脏移植模型建立的质量及成功性。

一种经济高效的SD大鼠胰岛细胞分离技术

目的建立一种经济高效的大鼠胰岛细胞分离纯化方法,为胰腺的修复重建奠定实验基础。方法成年雄性SD大鼠25只,体重230～380g,共进行5次实验,每5只大鼠一组进行消化和分离。采用医用复方氯化钠注射液(compound sodium chloride injection,CSCI)经胰总管灌注大鼠胰腺,0.5mg/mLⅤ型胶原酶消化后,分别采用浓度为27.0%、23.0%、20.5%和11.0%的Ficoll 400形成不连续密度梯度介质,离心纯化胰岛细胞。双硫腙(dithizon,DTZ)染色行纯化前后胰岛细胞计数和纯度检测;荧光染料碘化丙啶(propidium iodide,PI)和二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)储存液双染色鉴定胰岛细胞活性;RPMI1640培养基培养3d后,分别用浓度为2.8mmol/L的低糖和25.0mmol/L的高糖行葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛细胞功能。结果5次实验胰岛细胞消化时间为(13.8±1.6)min。DTZ染色鉴定纯化前胰岛细胞数为(5626±422)个,纯化后为(2914±485)个,纯化后的胰岛细胞数较纯化前明显减少(P<0.01),回收率51.6%±6.0%,每个胰腺收获胰岛细胞数为(583±97)个/只。5次分离获得的胰岛细胞纯度为90.2%±3.4%,活性为81.6%±7.0%。培养3d后,葡萄糖刺激胰岛素释放实验显示:低糖环境下胰岛素水平为(39.7±7.5)EU/L,高糖环境为(116.1±17.4)EU/L,比较差异有统计学意义(P<0.01);刺激指数为3.0±0.4。结论采用CSCI作为大鼠胰岛细胞分离纯化的主要液体试剂,并采用低浓度Ⅴ型胶原酶消化,不仅可降低实验成本,同时可获得高质量的胰岛细胞。

14种食物不耐受血清特异性IgG抗体检测在临床中的应用价值

目的分析血清中14种食物不耐受特异性IgG抗体检测在临床中的应用价值,为临床相关疾病的诊治提供依据。方法对596例样本采用酶联免疫吸附法(ELISA)半定量检测血清中14种食物特异性IgG水平。结果患者组食物不耐受阳性率和14种食物血清特异性IgG抗体浓度均高于健康对照组,差异有显著性意义(P<0.05);4组症状组平均阳性率以蛋清/蛋黄最高(50.2%),其次为蟹(36.7%)、虾(31.4%)、牛奶(23.0%);平均IgG浓度也以蛋清/蛋黄最高(205.4U/ml),其次为牛奶(196.9U/ml)、西红柿(121.3U/ml)、猪肉(116.8U/ml)。结论患者体内产生食物特异性IgG抗体,提示患者症状与食物不耐受有关。及时明确不耐受食物,对临床相关疾病的诊治和预防具有一定的价值。

转化生长因子-β1对口腔癌相关成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的研究外源性转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对口腔癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle-actin,α-SMA)表达的影响,探讨TGF-β1对CAFs生物学性能的影响。方法以口腔正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)和未经处理的CAFs为对照组,采用蛋白印迹法观察10 ng/mL的TGF-β1溶液在作用12、24 h后对CAFs细胞中α-SMA表达的影响。结果未经处理的NFs组中未见明显α-SMA的表达,蛋白相对表达量为0.005;未经处理的CAFs组中可见明显α-SMA表达,蛋白相对表达量为0.355;10 ng/mL TGF-β1溶液刺激CAFs细胞12 h后,α-SMA表达较未刺激CAFs明显升高,蛋白相对表达量为0.900(P<0.001);10 ng/mL TGF-β1溶液刺激CAFs细胞24 h后,α-SMA表达持续升高,蛋白相对表达量为1.905(P<0.001)。与NFs组和CAFs组相比,10 ng/mL的TGF-β1溶液在作用12 h和24 h时能够明显上调CAFs细胞中α-SMA的表达(P<0.05),且作用24 h时更明显。结论 TGF-β1能够明显上调CAFs中α-SMA的表达,对CAFs的生物学性能具有重要影响。

CD4^+CD25^+CD127^-T细胞在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用

目的:研究CD4+CD25+CD127-T细胞在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中所发挥的作用,从而阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受作用的机制。方法:体内实验建立小鼠异位心脏移植模型,观察抗CD45RB抗体对移植物生存期的影响。体外实验观察抗CD45RB抗体对T细胞增殖抑制能力和对CD4+CD25+CD127-T细胞生成的影响。流式细胞术检测外周血和混合细胞中CD4+CD25+CD127-T细胞百分率,ELISA法检测血清和培养液中IL-2和IL-10含量,Real-TimePCR法检测脾脏和混合细胞中Foxp3基因的表达,移植心脏病理学观察。结果:抗CD45RB抗体显著延长移植物存活时间(P<0.01),对ConA刺激引起的T淋巴细胞增殖具有明显的抑制能力(P<0.05)。与对照组相比,实验组CD4+CD25+CD127-T细胞百分率和Foxp3 mRNA表达量均明显增加(P<0.05),实验组IL-2水平较对照组明显降低(P<0.05),但IL-10含量较对照组明显升高(P<0.05)。病理结果显示对照组移植心脏出现典型细胞免疫性损伤病理改变,而实验组中几乎无炎性细胞浸润现象。结论:抗CD45RB抗体能显著延长移植物存活时间,其诱导免疫耐受机制与上调CD4+CD25+CD127-T细胞百分率和增加Foxp3 mRNA表达量有关。

FAH基因敲除克隆小型猪的制备及繁育

目的供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditary tyrosinemia typeⅠ, HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤。对猪(Sus scrofa)进行基因编辑,建立FAH基因敲除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除巴马小型猪的基础上,通过CRISPR/Cas9技术制备FAH基因敲除(FAH^(+/-)、FAH^(-/-))小型猪,并分析其健康与繁育状况。方法针对猪FAH基因设计单链导向RNA (single guide RNA, sgRNA)构建pX330表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama minipigs, BMEF)并进行敲除效率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植技术制备FAH基因敲除巴马小型猪。提取仔猪的基因组DNA,经PCR测序后得到突变类型;采集5月龄FAH^(+/-)巴马小型猪血液,检测其血生化与血常规指标并观察肝组织学染色切片;当FAH^(+/-)巴马小型猪公猪性成熟后,与野生型(wild type, WT)母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况。结果得到了FAH^(+/-)巴马小型猪,Western blot显示FAH^(+/-)巴马小型猪的肝和肾中FAH的表达量均有所下降;FAH^(+/-)猪与野生型相比,FAH^(+/-)猪血液理化指标无显著差异;组织学切片染色发现FAH^(+/-)猪肝组织形态出现空泡样变化;与FAH^(+/-)公猪配种的野生母猪产仔数正常;FAH^(+/-)猪具有正常的健康状况和繁育能力。结论本研究制备出了FAH单基因敲除小型猪,健康状况及繁育能力正常,该单基因敲除猪为将来制备出双等位基因敲除猪与人源化肝的研究提供了良好基础。

免疫细胞能量代谢与移植相关性研究进展

细胞能量代谢对于细胞的生长和功能至关重要。代谢状态影响着免疫细胞的生长和效应，不同分化或活化阶段的免疫细胞会选择不同的代谢途径以保证自身功能的正常需求。近年来，基于免疫细胞代谢的研究为免疫学提供了新的视角与进展，但如何将免疫细胞代谢的调节与移植相结合仍需要进一步研究。

猪胰岛细胞微囊化后腹腔移植治疗小鼠糖尿病

目的探讨猪胰岛细胞微囊化后腹腔移植治疗小鼠糖尿病的效果。方法采用胶原酶灌注消化法及不连续密度梯度离心法分离并纯化成体猪胰岛，并用海藻酸钠、多聚赖氨酸对猪胰岛进行微囊化。双硫腙（DTZ）染色观察分离胰岛纯度，葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测纯化胰岛和微囊化胰岛体外功能。利用链脲佐菌素（STZ）200mg／kg腹腔内注射，制作BALB／c小鼠1型糖尿病动物模型。成模后动物随机分为3组：猪胰岛微囊组、空微囊组和生理盐水对照组。每只小鼠腹腔内分别移植500个相应胰岛，检测移植前后小鼠的血糖变化。采用单因素方差分析法进行统计分析。结果不连续密度梯度离心纯化后，得到胰岛的纯度为〉90％；碘化丙啶／双醋酸荧光素（PI／FDA）染色后，测定胰岛的活力为〉90％；葡萄糖刺激胰岛素分泌检测，分离纯化的胰岛和微囊化胰岛的刺激指数均〉2．0；将微囊化胰岛移植到STZ诱导的糖尿病小鼠腹腔内，能够使小鼠血糖恢复并维持正常超过60d〈9．3mmol／L）。与空囊移植组和生理盐水对照组比较，血糖为正常水平的控制时间明显延长（F=13．587，P〈0．05）。病理学检查发现，微囊内胰岛形态基本完整，胰岛素染色为阳性。结论微囊化胰岛腹腔移植后，能有效降低小鼠血糖，微囊具有较好的免疫隔离作用。

天然恒磁场对肝癌细胞系增殖影响的研究

目的研究天然恒磁场对3个人肝癌细胞系增殖的影响。方法将3个人肝癌细胞系BEL-7402、HEPG-2及QGY-7701分别暴露于0．1T、固定600Hz频率的天然恒磁场，以及0．2T、频率分别为F1（250Hz）、F2（400Hz）、F3（500Hz）的天然恒磁场中。每天磁曝时间为30min，磁曝天数分为3d组与6d组，每组设置对照组与磁曝组。完成磁曝后以流式细胞仪及细胞增殖检测试剂盒检测细胞凋亡与增殖。以t检验对比磁曝组与对照之间结果的差别。结果仅有0．2T400Hz条件下的天然恒磁场可诱导BEL．7402细胞系凋亡，而同一条件下不能诱导其余2个人肝癌细胞系凋亡。结论同一疾病不同细胞系对同一磁场的不同反应揭示了不同细胞系之间特性的差别，其中可能的机制需进一步研究。不同细胞对同一磁场的不同反应提示在临床中应采用个体化磁场治疗方案以取得较好疗效。

异种移植新进展:从实验到临床

2022年1月7日美国马里兰大学医学中心报道了全球第1例基因编辑猪心脏成功移植到1例57岁患有终末期心脏病的男性患者体内,引起了全球轰动。基因编辑猪心脏移植到人体内成功存活59 d而没有出现早期排斥,迈出了异种器官移植走向临床的关键一步。笔者重点探讨了基因编辑在减轻免疫排斥反应中的作用,总结了本次马里兰医学中心异种心脏移植案例,并且对异种移植现状以及异种移植尚未解决的问题进行了概述,期望未来异种移植能成功走进临床。

GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猕猴3例报道

目的探索GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果。方法本研究采用GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞开展了3例猪-猴异种胰岛移植实验。结果3只猕猴成功进行胰岛细胞移植治疗,术后生命体征平稳,未发生静脉栓塞症状。移植后血糖和外源胰岛素用量均显著降低,能检测到特异性猪C肽。移植后3只猕猴均发生了酮症酸中毒症状,1只猕猴发生伤口感染,经对症处理后均健康存活达16周。结论GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞经肝门静脉移植治疗1型糖尿病的方法是有效的。

内源性小核糖核酸在糖尿病领域的研究进展

2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病,其发生发展涉及多种基因和蛋白质,而内源性小RNA(MicroRNA,简称miRNA)的发现则为糖尿病的研究开辟了新视角.miRNA是牛物体内生成的具备基因功能调节的非编码短序列RNA,长度为20～23个核苷酸;它在进化中的高度保守性及在表达时间和空间上的特异性蕴示着它对生物的生长发育、组织功能具有苇要的调控作用.