肝纤维化的实验动物模型

本文讨论了建立肝纤维化动物模型的技术与存在的问题,以大鼠为主要动物讨论了目前常用的几种造模方法、每种造模方法的致病机理、造模途径、效果,同时比较了不同造模方法的优缺点及各自的用途,提出了肝纤维化动物模型领域的研究方向。

乙型肝炎病毒感染患者肝移植术后再感染及其机制

肝移植已成为终末期肝脏疾病的一个重要治疗手段.但是,乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病患者肝移植术后,乙型肝炎的复发率达70%～80%,严重地影响了肝移植术的远期效果,成为亟待解决的一个问题.

乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒 ,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 采用常规 PCR法扩增 S、前 S2 - S、前 S1 -前 S2 - S片断 ,利用重叠 PCR法扩增出前 S1 - S片断后 ,分别插入 Rc/ CMV及 p SG5 U TPL/ Flag载体质粒中 ,并在其 ATG起始密码前加入 KOZAK序列后转染 SP2 / 0细胞 ,Western- Blot杂交检测所表达蛋白 ,并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果 插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前 S1 - S蛋白的编码基因一致 ,Western- Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论 获得了 8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前 S1 - S蛋白的真核细胞表达质粒。

乙肝核酸疫苗NV-HB/s接种小鼠的免疫反应

目的 研究乙型肝炎核酸疫苗 NV- HB/s经肌肉注射、皮下注射、转化伤寒杆菌 CVD90 8后再经口服等不同途径接种小鼠后 ,小鼠产生体液免疫应答的规律 ,以及磷酸钙在提高核酸疫苗免疫效能中的作用。方法用自制的乙肝核酸疫苗、佐剂化乙肝核酸疫苗及口服疫苗 ,以不同接种途径免疫小鼠 ,分别检测小鼠外周血中的HBs Ag及抗 HBs;肌肉组织标本中的疫苗质粒以及 C- m yc m RNA。结果 肌注 NV- HB/s 3天后 ,在接种部位检出了 HBs Ag;1月后外周血中检出了抗 HBs。肌注与皮下注射对 NV- HB/s的免疫效能无显著影响 ;口服接种所诱生的抗 HBs阳转率及滴度低于肌肉注射与皮下注射。磷酸钙处理可降低核酸疫苗的用量 ,增加其安全性。结论 乙肝核酸疫苗 NV- HB/s能有效地诱导小鼠产生抗 HBs;在免疫后 6个月内 。

慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞不同洗涤方法对HBVDNA检测的影响

目的 :慢性乙型肝炎患者外周血单个核淋巴细胞 (Peipheralbloodmononuclearcells,PBMC)不同洗涤方法对HBVDNA检测的影响。方法 :淋巴细胞分离液常规密度梯度法分离 1例血清HBVDNA阳性慢性乙型肝炎患者PBMC后 ,分别采用常规洗涤法和改良洗涤法 (后者即在常规洗涤法的基础上第 2、 4次洗涤前不重悬细胞 ,直接加入洗液后离心 ) ,计算细胞收获得率和细胞存活率 ,荧光定量PCR法检测 1、 3、 5次洗液样本和细胞样本的HBVDNA ,重复实验 3次。结果 :常规法第 1、 3、 5次洗液样本HBVDNA均阳性 ,改良法洗涤 5次后洗液样本HBVDNA均阴性 ;改良法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为 95 %和 98% ,常规法洗涤的细胞得率和细胞存活率分别为 71%和 83% ;不论常规洗涤法和改良洗涤法收获的PBMC均可检出HBVDNA。结论 :慢性乙型肝炎患者PBMC改良洗涤法优于常规洗涤法 ,适用于PBMC中HBVDNA荧光定量PCR检测。

丙型肝炎病毒核酸疫苗NV-HC/NS_3的免疫预防和治疗效应研究

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核酸疫苗ＮＶ－ＨＣ／ＮＳ３接种ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠后，对相应靶抗原攻击的特异性免疫预防和治疗效应、方法以ＨＣＶ核酸疫苗ＮＶ－ＨＣ／ＮＳ３接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，分别在疫苗接种前后种植能表达靶抗原的ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠骨髓瘤细胞株ＳＰ２／０，观察疫苗接种对肿瘤生长及小鼠寿命的影响。结果种植肿瘤前先接种ＮＶ－ＨＣ／ＮＳ３的小鼠，荷瘤阻抑率达４０％；长出肿瘤的小鼠与未接种疫苗的对照组小鼠相比，生存时间延长，生存率提高。先荷瘤后免疫的小鼠，核酸疫苗的接种则能提高小鼠的生存率。结论ＮＶ－ＨＣ／ＮＳ３能诱导小鼠产生针对靶抗原的特异性免疫应答，发挥预防甚至治疗效应。

肝细胞核因子3结合位点的突变及对抑制乙型肝炎病毒复制的影响

目的研究肝细胞核因子（HNF）3结合位点HNF3β对HBV转录和复制调节作用的机制。方法通过分别位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1P和Sp区上的HNF3结合位点，构建HBV基因组2个或3个位点的复合突变，获得4个复合突变型重组质粒；分别转染非肝源性细胞小鼠成纤维细胞株（NIH3T3），Northern印迹法检测3．5kb、2．4kb／2．1kb、0．7kbHBVRNA的转录水平，Southern印迹法检测HBVDNA复制中间体水平．观察上述突变是否会影响HNF313对HBV转录和复制的抑制作用。结果在被转染的非肝源性细胞3T3中，HNF313仍能降低4个复合突变型HBV重组质粒3．5kbHBVRNA的转录水平，抑制HBVDNA的复制；与未共转染HNF3B相比，转录水平下降50％～75％、复制水平下降80％～96％。结论在位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和Sp区上的3个HNF3结合位点中，即使其中2个或3个结合位点同时联合突变，HNF313仍能抑制HBV的转录和复制。Pp、PS1p和Sp区HNF3结合位点的突变不能阻断HNF313对HBV复制的抑制作用。

乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠后HBsAg的表达和抗-HBs的诱生及局部病理观察

目的研究乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后在体内的表达及小鼠体液免疫应答的规律，同时观察接种局部组织的病理变化。方法以乙型肝炎核酸疫苗ＮＶ－ＨＢ／ｓ肌注小鼠，然后定期分批处死，采集肌注局部组织检测ＨＢｓＡｇ（ＡＢＣ免疫组化法），采集外周血标本检测ＨＢｓＡｇ和抗－ＨＢｓ（ＥＬＩＳＡ法），并常规病理检查。结果接种乙型肝炎核酸疫苗后１周，ＨＢｓＡｇ的表达即可在部分受检小鼠的肌注局部组织内检出；接种后２周，全部受检小鼠的肌注局部组织ＨＢｓＡｇ检测均呈阳性，部分受检小鼠的外周血抗－ＨＢｓ亦阳转，此后检出率进一步增高。接种后１个月，受检小鼠抗－ＨＢｓ即全部阳转并持续到接种后半年以上；同期间内，至少７５％的受检小鼠其肌注部位组织仍保持ＨＢｓＡｇ检出阳性，而其外周血标本内的ＨＢｓＡｇ检测则始终呈阴性。病理检查提示：核酸疫苗接种后，仅在肌注局部出现一过性非特异性炎症反应。结论乙型肝炎核酸疫苗ＮＶ－ＨＢ／ｓ肌注接种小鼠后，可通过在注射部位组织中表达ＨＢｓＡｇ，在其体内诱生特异性抗－ＨＢｓ。

四环素基因表达调控系统介导的HBVX基因体外表达细胞株的建立

目的 建立稳定、高效的HBxAg体外表达细胞株 ,以便进一步研究HBVX基因和HBxAg的致癌作用及机理。方法 构建带有完整四环素基因关闭 (Tet off)系统的HBVX基因重组表达质粒pBPSTR1 FlagX ,用该重组质粒转染NIH 3T3细胞 ,筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆 ,用抗 FlagM2 单抗和兔抗 HBx作蛋白质免疫印迹分析 ,检测细胞内Flag HBxAg表达和四环素调控其表达的情况。结果 重组质粒pBPSTR1 FlagX转染NIH 3T3细胞后获得 30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆。其中 12个细胞克隆有Flag HBxAg的稳定表达 ,且有 5个克隆的Flag HBxAg表达受四环素调控。当四环素浓度逐渐增高时 ,细胞内Flag HBxAg的表达逐渐减弱。四环素浓度达 1μg ml时 ,Flag HBxAg表达被完全抑制。结论 本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBVX基因体外表达细胞株 ,该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg ,而且具有定时“开”“关”和定量调节HBxAg表达水平的特性 。