牦牛IGF-Ⅱ干扰载体的构建及其转染对睾丸支持细胞的影响

旨在构建干扰胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)的重组质粒载体,研究IGF-Ⅱ对牦牛睾丸支持细胞的影响。本研究设计并合成针对牦牛IGF-Ⅱ的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染牦牛睾丸支持细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测IGF-Ⅱ基因和蛋白的表达,采用细胞生长分析仪分析支持细胞的增殖凋亡情况。结果显示,干扰牦牛IGF-Ⅱ表达的pLKO.1质粒载体构建成功,其可在睾丸支持细胞中稳定表达,且能有效抑制IGF-Ⅱ基因的表达。与对照组相比,pLKO.1-shRNA2的干扰效率最显著,IGF-Ⅱ的表达量下调至19.1%(P<0.05),且pLKO.1-shRNA2可使内源性IGF-Ⅱ蛋白的表达量减少76.3%(P<0.05)。pLKO.1-shRNA2质粒转染及筛选得到的稳定细胞株培养48 h后的细胞分裂增殖活性显著低于对照组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,干扰内源性IGF-Ⅱ后,睾丸支持细胞中的IGF-Ⅰ和IGF-ⅡR基因表达出现了显著的上调(P<0.05),IGF-IR与Bcl-2的表达出现了显著的下调(P<0.05)。综上表明,牦牛IGF-Ⅱ干扰质粒构建成功,其转染至牦牛睾丸支持细胞有效抑制了IGF-Ⅱ的表达,改变了IGF-IR与Bcl-2的表达模式,潜在影响了牦牛支持细胞的分裂增殖,具体作用机制有待进一步研究。

KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响

旨在探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响。本研究在体外成熟液中添加不同浓度的KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,牦牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养过程中卵母细胞内KDM1A的表达模式;采用实时荧光定量PCR检测体外培养卵母细胞内Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog的表达水平;体外培养成熟后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h后,GSK-KDM1A组的卵丘细胞扩展程度显著低于对照组(P<0.05),而320 nmol·L^-1组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率均显著低于160 nmol·L^-1组(P<0.05)。在卵母细胞体外成熟过程中,Kdm1a呈现动态表达模式,MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期(P<0.05);添加GSK-KDM1A能显著抑制卵母细胞中KDM1A蛋白的表达(P<0.05),320 nmol·L^-1组各时间点KDM1A的表达量均显著低于160 nmol·L^-1组(P<0.05)。GSK-KDM1A组卵母细胞内Oct-4与Sox-2的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但Nanog的表达水平无显著差异(P>0.05)。牦牛卵母细胞体外成熟后,GSK-KDM1A组的卵裂率显著低于对照组(P<0.05),但囊胚形成率无显著变化(P>0.05)。综上表明,KDM1A参与调控牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程,GSK-KDM1A能有效抑制KDM1A的表达,影响卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能,揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。

犏牛高效生产新模式的建立

犏牛是牦牛与奶(肉)牛杂交的后代,具有明显的杂种优势,是牦牛育种改良的重要方向之一。由于雄性犏牛不育,杂种优势无法稳定遗传。因此,利用现代繁殖育种技术是解决此问题的关键。本研究利用牦牛屠宰场的卵巢收集卵母细胞,与奶(肉)牛的冻精进行体外受精,将获得的胚胎移植到同期发情的犏牛体内,建立生产犏牛新模式。结果表明,用荷斯坦牛、西门塔尔牛和娟姗牛的冻精与牦牛卵母细胞体外受精,受精率无显著差异(P>0.05),但显著高于牦牛种内体外受精(P<0.05)。胚胎发育动力学结果表明,犏牛胚胎的体外发育速率显著高于牦牛胚胎(P<0.05);雄性犏牛胚胎的发育显著快于雌性胚胎。用孕酮阴道栓、马绒毛膜促性腺激素(eCG)和氯前列腺烯醇(PG)组合的同期发情处理方案,诱导犏牛发情效果较好,发情率显著高于单独使用PG组(P<0.05)。获得了全球首批试管犏牛(7头),实现了犏牛生犏牛新模式。获得的试管犏牛体型丰满、生长迅速、1周岁的体质量达160 kg,是同龄牦牛的2倍。综上,本研究建立了一套高效的犏牛体外生产技术体系,充分利用了母犏牛的繁殖性能,为挖掘优秀母犏牛的繁殖潜能和加速扩繁犏牛奠定了基础,对实现少数民族地区牧民增收与生态保护具有重要的意义。