不结球白菜遗传育种与分子生物学研究进展

不结球白菜起源于中国,其种质资源丰富,生长周期短,产量高,且富含丰富的营养物质,是中国长江中下游广泛种植的大众蔬菜。本文从不结球白菜的6个变种、优异种质资源、育种技术的发展及应用等方面入手,论述了不结球白菜遗传育种技术与分子生物学研究进展及存在的问题。针对这些问题,提出在种质资源方面,继续搜集不结球白菜原生境边缘种质资源,创制更多育种材料;在育种技术方面,加强基于基因组的分子设计育种技术研究;在分子生物学方面,急需建立高效的不结球白菜遗传转化和基因编辑技术体系。为不结球白菜新品种培育及分子生物学研究提供理论依据。

菊花茎尖克隆体外繁殖研究

[目的]研究不同因子对菊花芽苗体外繁殖的影响。[方法]以秋菊品种"绣球"和"妃子笑"的顶芽或半木质化茎段为外植体,研究不同激素及组合对菊花芽苗体外繁殖的影响。[结果]在MS+BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L的诱导培养基上两品种均能诱导分化出芽。在芽的生长增殖阶段,接种到MS+BA 1.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA 0.1 mg/L的增殖培养基上,"红绣球"和"妃子笑"的增殖系数分别可达6.8和6.4,芽苗生长速度快,生长健壮。在1/2 MS+IBA 0.5 mg/L的生根培养基上,生根所用时间短,根系数量大且粗细始终,移栽成活率较高。[结论]该研究为"绣球"和"妃子笑"菊花品种的组培快繁提供了理论与技术支持。

江苏小白菜产业链关键技术的创新与应用

江苏现代农业(蔬菜)产业技术体系集成创新中心叶菜类蔬菜创新团队,依据江苏省农业委员会(农业农村厅)关于印发《江苏现代农业产业技术体系建设方案》的通知(苏农科[2017]17号)和《江苏省蔬菜产业技术体系工作细则》于2017年3月成立,围绕叶菜(主要是不结球白菜,又名小白菜)产业链。

低温等离子体技术在蔬菜、微生物及农作物种子诱变中的应用

以等离子体是什么为切入点,介绍了等离子体研究现状和诱变技术原理。综述了低温等离子技术在蔬菜和农作物领域的应用,阐明了高压电场低温等离子体处理不结球白菜种子对生长发育的影响。围绕低温等离子体在蔬菜、微生物及农作物中的诱变研究,论述了高压电场低温等离子体诱变不结球白菜种子的效果和应用前景。

不结球白菜BcGR2.1基因的功能验证及响应光氧化胁迫研究

[目的]本文旨在研究不结球白菜BcGR2.1基因在光氧化胁迫下的表达模式,并探索过表达或沉默该基因对植物抗光氧化胁迫的影响,以明确基因的功能。[方法]从不结球白菜中克隆了BcGR2.1基因CDS序列,对其编码的氨基酸序列进行进化树和保守区域分析;采用RT-qPCR技术,对BcGR2.1基因在光氧化胁迫处理下的表达水平进行分析;利用农杆菌介导的蘸花法和病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术分别获得BcGR2.1过表达拟南芥和BcGR2.1沉默不结球白菜植株,并验证过表达或沉默BcGR2.1基因对植物抗光氧化胁迫能力的影响。[结果]不结球白菜BcGR2.1基因ORF全长1626 bp,与芜菁GR2蛋白进化关系最近。在甲基紫精(MV)处理诱导的光氧化胁迫下,该基因一定时间内表达量上调,随后下调。过表达转基因拟南芥中抗坏血酸(AsA)含量上升,而沉默植株中AsA含量下降。光氧化胁迫条件下,过表达转基因拟南芥中的H_(2)O_(2)含量显著低于野生型,而BcGR2.1沉默植株中H_(2)O_(2)含量显著高于PTY空载植株;此外,过表达BcGR2.1拟南芥中相关叶绿素荧光动力学参数F v/F m、Y(Ⅱ)、ETR以及qP均显著高于野生型。[结论]在拟南芥和不结球白菜中BcGR2.1正调控AsA含量,抑制光氧化胁迫处理下植株体内H_(2)O_(2)的爆发,一定程度上维护了植株叶绿素荧光参数的正常状态,提高了植物对光氧化胁迫的耐受性。

从中国蔬菜种业现状看江苏及长三角地区蔬菜种业创新发展

中国是世界人口第一大国,蔬菜的种植面积、总产量与平均消费量均为全球第一。蔬菜种业是农业高科技战略性产业,全面提升全国、长三角地区乃至江苏蔬菜种业科技的竞争力,不仅可以引领蔬菜产业向高质量高效益转型,而且能满足人们对美好生活的向往,对于加快蔬菜产业升级、提升产品附加值、促进农民增收、推动乡村振兴战略的实施都具有重要意义。

不结球白菜BcMLPK基因在自交不亲和中的功能研究

该研究以不结球白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)自交不亲和系品种‘矮脚黄’为实验材料,利用VIGS技术将BcMLPK基因构建到pTY载体,进行定量分析,研究其在自交不亲和中的功能。结果表明:(1)BcMLPK基因序列长为1 443 bp,编码480个氨基酸,将BcMLPK蛋白氨基酸序列与其他物种的MLPK氨基酸比较表明,BcMLPK基因与其他物种中该基因具有高度保守的结构域。(2)成功构建pTY-BcMLPK载体,采用基因枪法侵染‘矮脚黄’,其新生的真叶有明显的花叶症状,选取发病的叶片及花蕾进行实时定量qRT-PCR,发现侵染的植株中BcMLPK基因表达量约为对照组的50%。(3)花期对植株进行自交授粉,实验组有明显的结荚现象,而对照组则出现雌蕊未能明显伸长,显示受精异常的现象;统计结果表明实验组的自交不亲和指数和结实率均高于对照组。研究表明,不结球白菜MLPK基因的沉默能够抑制‘矮脚黄’自交不亲和相关基因BcMLPK的转录水平表达。

优质同源四倍体菜心新材料的创制及特性分析

为获得优质的菜心同源四倍体新材料,本研究采用0.2%(W/V)的秋水仙素溶液点滴二倍体菜心LCX017幼苗子叶生长点,通过形态学、解剖学、细胞学以及流式细胞仪等方式鉴定到诱导成功的同源四倍体植株,并对二、四倍体的农艺性状、营养品质、光合特性等方面进行分析比较。结果表明,形态学与农艺性状方面,四倍体植株在叶片、花器官、种荚等方面表现出“巨大性”,叶宽、叶厚增大,菜薹直径变粗,重量增大;解剖学方面,四倍体叶片气孔相对二倍体更大,气孔密度降低;花粉粒相比二倍体变大且呈现棒状或橄榄状;细胞学方面,四倍体植株的根尖染色体数目是二倍体的2倍;流式细胞仪鉴定结果显示,四倍体的DNA荧光强度是二倍体的2倍;营养品质方面,相较于二倍体,四倍体植株中可溶性糖、纤维素、有机酸以及叶绿素含量显著上升,硝态氮含量下降22.92%,可溶性蛋白含量无显著变化;此外,结合光响应曲线分析发现,四倍体在强光和弱光条件下的适应能力均强于二倍体。综上,本研究成功诱导出了优质的同源四倍体菜心新材料,丰富了不结球白菜的种质资源。

同源四倍体菜薹新材料的创制与品质分析

[目的]本文旨在创制优质的菜薹四倍体新材料。[方法]用2 g·L^(-1)秋水仙素溶液点滴二倍体菜薹LCX019幼苗的子叶生长点,通过形态学、解剖学、细胞学与流式细胞仪的方式筛选鉴定出同源四倍体植株,并对二、四倍体植株的农艺性状以及品质特性进行分析比较。[结果]形态学与解剖学结果显示,同源四倍体菜薹在株型、叶片、花、种荚、菜薹等方面表现出“巨大性”的特点;气孔孔径变大,气孔密度下降;花粉粒体积相比二倍体增大,形状呈橄榄球形或不规则形状。细胞学结果显示,四倍体菜薹根尖染色体数目为二倍体的2倍;流式细胞仪的分析结果表明,四倍体的DNA荧光强度约为二倍体的2倍。四倍体菜薹的可溶性糖、有机酸及纤维素含量显著增加76.17%、13.71%和80.34%,叶绿素含量、硝态氮含量显著下降25.01%、45.10%,可溶性蛋白含量无显著变化。通过分析二、四倍体的光响应曲线与光合特性,发现四倍体菜薹LCX019对弱光的利用能力强于二倍体植株。[结论]获得了具有优良品质的菜薹同源四倍体新材料,为菜薹育种提供新的种质资源。

不结球白菜GST基因家族的全基因组鉴定及花青素相关基因Bc GSTF6的功能分析

【背景】花青素是紫色不结球白菜中重要的营养成分之一,谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)在花青素转运中发挥着重要功能。【目的】鉴定不结球白菜中编码GST的基因,并通过转录组和分子生物学手段揭示BcGSTF6在不结球白菜花青素转运中的作用,解析不结球白菜花青素积累的分子机制。【方法】通过生物信息学方法,鉴定GST基因家族成员并分析其在染色体上的位置和基序;在紫色和绿色的不结球白菜中进行转录组分析,筛选不结球白菜中参与花青素转运的基因,并通过表达模式分析、亚细胞定位、拟南芥突变体tt19的异源回补试验进一步验证BcGSTF6和BcTT19的功能;通过将BcGSTF6和BcTT19与其他物种中参与花青素转运基因的氨基酸序列进行比较,分析BcGSTF6存在的差异;并通过BcGSTF6蛋白与矢车菊素(Cya)的体外结合和基因沉默试验验证BcGSTF6是否为参与不结球白菜花青素转运和积累的重要基因。【结果】从不结球白菜中鉴定得到83个GST基因家族成员,分为8个亚家族,分布在10条染色体上。转录组分析结果表明BcGSTF6和BcTT19可能是参与不结球白菜花青素转运的基因,进一步利用qRT-PCR发现BcGSTF6与BcTT19都在不结球白菜花青素积累阶段高度表达;亚细胞定位结果表明BcGSTF6和BcTT19都定位于内质网和液泡膜中。氨基酸序列多重比较发现BcTT19与其他物种中参与花青素转运的蛋白存在高度同源性,而BcGSTF6则在保守结构域中存在较大差异。在拟南芥突变体tt19中对BcGSTF6和BcTT19进行过表达均可恢复拟南芥幼苗tt19积累花青素的表型,但不能恢复其种皮棕色的表型,表明BcGSTF6和BcTT19都参与了花青素的转运但不能转运原花青素(PAs)。体外结合试验发现BcGSTF6蛋白在室温下可增加Cya的可溶性;对BcGSTF6在不结球白菜中进行基因沉默发现叶片中花青素含量显著下降,同时也导致参与花青素合成与调控相关基因表达量降低。证明BcGSTF6参与了花青素的转运和积累,在不结球白菜叶片着色过程中发挥重要功能。【结论】本研究鉴定了不结球白菜GST基因家族,并进一步解析了BcTT19和BcGSTF6在不结球白菜花青素转运和积累中的功能,阐明了BcGSTs在不结球白菜中花青素转运调控的部分机制。

不同浓度EMS诱变不结球白菜的效果分析

为创制不结球白菜新种质,发掘新基因,探索不同浓度甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)对不结球白菜的诱变效应。采用浓度为0.4%、0.6%和0.8%的EMS溶液对4个不结球白菜品种[黑塌菜(HTC)、香青菜(XQC)、JP241、XWZ]进行种子诱变处理,调查种子发芽情况与田间植株农艺性状表现。结果表明:4个不结球白菜品种的种子发芽势、发芽率和相对成苗率均随着EMS浓度的升高而逐渐降低,且处理间差异显著。EMS诱变可以引起不结球白菜叶色、叶形、株型、花器官等性状发生变异。不同品种不结球白菜的EMS诱变半致死剂量有所不同,产生的变异种类和变异频率也有所不同,HTC的半致死剂量为0.8%,相对变异频率为23.83%;XQC的半致死剂量为0.8%,相对变异频率为17.61%;JP241的半致死剂量为0.6%,相对变异频率为38.45%;XWZ的半致死剂量为0.6%,相对变异频率16.69%。EMS的浓度越高,诱变的不结球白菜始花开放时间越晚,莲座叶叶片数越少,雄性不育率越高。

苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交(Fiber FISH)技术体系,从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材,通过液氮研磨,尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解,采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体(Bacterium Artificial Chromosome)BAC 34G16、BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化,用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2—3 d和洗片,采用"三明治"方法进行信号放大和检测,在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料,液氮研磨提取细胞核,碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整,细胞核浓度>5×103个/μL。试验结果表明,细胞核裂解4 min,在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀,纤维量多、细长,效果好。经原位杂交和信号检测,获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的"念珠状"杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析,得出BAC克隆大小(Y,Kb)与信号长度(X,μm)的相关方程为Y=3.47X(R2=0.9215),其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb·μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定,它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3)kb,之间有(90.2±7.3)kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核,制备DNA纤维和原位杂交的方法,获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。

被人们遗忘的蔬菜第一大作用功能——调节人体的酸碱平衡

蔬菜,尤其是绿叶蔬菜都属于碱性食物。蔬菜,可以中和人体内大量的酸性食物,如肉类、淀粉类食物。蔬菜是我国人民膳食结构中极为重要的组成部分,中国人尤其喜食新鲜蔬菜。从营养学的角度看,蔬菜的营养功能主要是供给人体所必需的多种维生素、矿物质、微量元素、酶以及一部分热能和蛋白质;还能帮助消化、改善血液循环等;但它最重要的功能是调节人体酸碱平衡。

长三角一体化背景下的现代农业发展趋势--以蔬菜产业为例

“长三角一体化”的提出,推动了改革的深化,提供了更高层次的对外开放。经改革开放以来的不断实践,我国农业快速发展、农民生活质量显著提升。现以现代农业的内涵为切入点,结合发展现状,讨论现代农业发展方向和蔬菜科技及其产业发展目标。

高产、抗病同源四倍体不结球白菜黄心乌新材料的创制

不结球白菜黄心乌是长江中下游流域特别是安徽地区的主栽品种之一。为获得品质优良的黄心乌新材料,本研究使用0.2%(w/v)的秋水仙素溶液点滴处理二倍体黄心乌幼苗的子叶生长点,通过形态学和细胞学的方法筛选到同源四倍体黄心乌植株,并对二、四倍体黄心乌的农艺性状以及品质进行分析。形态学研究结果表明,四倍体植株的株型、叶片、花、种荚表现出巨大型;四倍体叶片的气孔变大,气孔密度变小;花粉粒体积比二倍体变大且呈现出棒状。细胞学分析结果发现,四倍体植株的根尖染色体数目是二倍体的2倍。流式细胞仪分析结果表明,四倍体植株的荧光强度为二倍体的2倍。营养品质方面,与二倍体相比,四倍体纤维素、有机酸含量显著上升,叶绿素、硝态氮含量显著下降,可溶性糖及可溶性蛋白含量无显著变化。此外,结合光响应曲线分析结果发现,强光条件下,四倍体对光强的适应能力更强。在抗病性检测中发现,四倍体的灰霉菌抗性明显优于二倍体。本研究获得了高产、抗病的同源四倍体不结球白菜黄心乌新材料,为不结球白菜育种工作提供了新的种质资源。

不结球白菜BcICE1基因的克隆与功能分析

[目的]本文旨在分析不结球白菜BcICE1基因的表达模式并探索其在冷胁迫中的功能。[方法]以不结球白菜品种‘NHCC001’为材料,采用同源克隆的方法获得BcICE1基因的全长序列,并进行生物信息学分析;对‘NHCC001’进行4℃低温和PEG-6000模拟干旱处理,检测BcICE1基因对胁迫的响应;构建过表达载体pEarlyGate-BcICE1,利用注射法将载体农杆菌菌液导入烟草细胞进行BcICE1基因的瞬时表达并检测;构建酵母诱饵载体pGBKT7-BcICE1,转化AH109验证其转录激活活性;将pEarlyGate-BcICE1农杆菌菌液利用蘸花法进行BcICE1基因的遗传转化,并用RT-qPCR和Westernblot对阳性苗进行鉴定。通过RT-qPCR对BcICE1过表达拟南芥中冷胁迫相关基因的表达水平进行分析。[结果]克隆获得不结球白菜BcICE1基因,其含有1338bp的开放阅读框,编码466个氨基酸,相对分子质量为47.40×10^3,等电点为5.42;氨基酸的多序列比对和系统进化树结果表明,BcICE1蛋白与欧洲油菜、荠菜和拟南芥ICE1蛋白同源关系较近。亚细胞定位表明BcICE1蛋白定位在细胞核中,具有转录激活性且对冷胁迫与干旱胁迫有响应。BcICE1过表达株系能增强植株的抗寒性,同时在低温处理后BcICE1过表达植株中冷胁迫相关基因AtCBF3和COR15A的表达量显著高于野生型植株。[结论]克隆并获得BcICE1过表达拟南芥植株,功能分析表明BcICE1基因能增强植株抗寒性。

不结球白菜抗坏血酸相关基因BcMDHAR2功能验证

[目的]本文旨在验证单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)多基因家族中MDHAR2基因的功能,以探索其对不结球白菜抗坏血酸(AsA)含量的影响。[方法]以不结球白菜‘苏州青’cDNA为模板,扩增BcMDHAR2基因的ORF全长,利用生物信息学分析其氨基酸序列;通过亚细胞定位研究BcMDHAR2在细胞中的表达位置,采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测非生物胁迫和激素处理下BcMDHAR2基因的表达量;通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)验证该基因对抗坏血酸含量的影响。[结果]BcMDHAR2基因包含1个1308 bp的开放式阅读框(ORF),编码435个氨基酸。进化树分析表明,BcMDHAR2蛋白与芜菁的进化关系最近。亚细胞定位显示,BcMDHAR2定位于细胞核和细胞质、细胞膜上。RT-qPCR表明,低温、盐胁迫、重金属离子以及外源激素处理下,在一定时间内BcMDHAR2表达量上调,随后下调。该基因对光周期有一定的响应,随着光照时间变长,表达量上调,黑暗后,BcMDHAR2表达量下调。BcMDHAR2基因沉默后植株中AsA含量降低,AsA循环中相关基因的表达量发生了一定变化,而植株中SOD活性升高。[结论]BcMDHAR2表达量随外界条件变化而变化,响应不同的激素诱导和胁迫,在不结球白菜中该基因正调控AsA含量。

不结球白菜开花相关基因BcGI的克隆、亚细胞定位及基因沉默功能验证

[目的]本文旨在揭示不结球白菜 GIGANTEA(GI)基因的功能,验证其与CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)基因之间的调控关系以及其在植物抽薹开花中的作用。[方法]以不结球白菜品种‘苏州青’为材料,提取RNA并反转录成cDNA,同源克隆 BcGI 基因,Gateway构建表达载体pEarleyGate101- BcGI -YFP,利用农杆菌介导法将表达载体注射入本氏烟草中,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。Gateway构建沉默载体 BcGI -RNAi,利用农杆菌介导法将沉默载体导入拟南芥中,观察野生型和转基因植株抽薹期的表型变化。采用RT-qPCR技术,检测 GI、CO、FT 基因在转基因和野生型拟南芥植株抽薹期的基因表达量。[结果]通过同源克隆,得到 BcGI 基因,其含有1个3 516 bp的开放阅读框(ORF),编码1 171个氨基酸。亚细胞定位结果显示,BcGI定位于细胞核中。RT-qPCR结果表明, BcGI 基因在沉默转基因植株中的相对表达量比野生型植株低;同时当 GI基因表达受到抑制时,CO、FT 基因在沉默转基因植株中的相对表达量也比野生型明显降低,沉默转基因植株与野生型相比表现为开花延迟且抽薹期莲座叶数明显增多。[结论] BcGI定位于细胞核,参与正向调控下游 CO、FT 基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。

高花青苷同源四倍体紫菜薹新材料的创制及特性分析

为获得优质高花青苷的同源四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b新材料,本研究利用浓度为0.2%(w/v)的秋水仙素溶液处理二倍体Lcx025b幼苗的子叶生长点,通过形态学、细胞学、流式细胞仪测定等方法筛选鉴定得到同源四倍体植株,通过农艺性状指标、营养品质、光合特性、抗病能力等方面对二、四倍体植株进行比较分析。结果表明,相较于二倍体植株,四倍体植株在形态学方面表现出巨大性,具体表现为叶片的长宽比显著减小,叶片趋于扁圆形,花器官、种荚、种子等明显增大,菜薹颜色加深;叶片气孔明显增大,气孔密度减小;花粉粒表现出明显不规则性;四倍体植株根尖细胞染色体的数目以及通过流式细胞仪分析的四倍体植株DNA的荧光强度都表现为二倍体的两倍;营养品质方面,可溶性糖、菜薹花青苷含量显著增加,纤维素、硝态氮含量显著减少,可溶性蛋白、叶绿素含量无显著变化;结合光响应曲线分析,四倍体光合能力更强,适应性更高;此外,在抗病性鉴定过程中,四倍体植株对灰霉菌的抗性明显优于二倍体植株。综上,本研究获得了高花青苷的同源四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b新材料,为不结球白菜的种质资源创新提供了重要的材料支撑。

苏南叶菜周年茬口和生产面临的问题及可持续发展建议

江苏省长江以南地区(以下简称苏南)蔬菜生产形势近年来发生了很大变化。随着苏南城市化进程不断加快,蔬菜生产全社会比较效益持续降低,尽管蔬菜总面积呈减少趋势,但是不能大量长途运输、苏南城乡居民喜食的城郊型叶菜生产仍然在不断调整中得到发展,如江苏小白菜每年播种面积为210万亩(14万hm2)左右,已成为全省第一大蔬菜作物。现就苏南叶菜周年茬口和生产面临的问题进行分析,并提出发展建议。