PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 。

一株H5亚型禽流感病毒NP蛋白两个鸡MHC分子限制性T细胞表位的鉴定

为验证一株禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)中的3条T细胞表位候选肽NP89-97(PKKTGGPIY)、NP198-206(KRGINDRNF)和NP64-71(ERMVLSAF)的免疫原性,本研究构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,间接免疫荧光和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得表达。重组质粒免疫鸡后,用间接酶联免疫实验检测发现重组质粒在鸡体内能诱导产生相应的抗体。将多肽NP89-97、NP198-206、NP64-71和不相关肽N71-78(WRRQARYK)在体外刺激免疫后鸡的脾淋巴细胞,流式细胞术检测发现CD8+T淋巴细胞增殖分别为13.7%、11.9%、0.6%和0.4%;ELISA检测结果显示多肽NP89-97、NP198-206刺激后的淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加。本实验表明多肽NP89-97和NP198-206能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,为AIV NP的T细胞表位。该研究结果对研究禽类抗流感病毒的免疫机制及抗流感疫苗具有重要的意义。