基于综合性、开放性实验对中药炮制实验教学的改革与体会

中药炮制实验教学侧重于实践，是中药炮制教学的重要环节，目前在中医药大学的炮制实验往往局限于传统和简单的理化实验，这样不利于学生综合全面掌握中药炮制知识。基于此对中药炮制的实验进行教学改革，增设综合性和开发性实验，这样更有利激发学生学习中药炮制的兴趣，培养更全面的中医药人才。

基于大鼠物质、能量代谢研究炮制对黄柏药性的影响

目的:以药效学指标比较黄柏、酒黄柏和盐黄柏的药性变化,探索黄柏炮制机制。方法:通过比较黄柏及其炮制品对大鼠宏观体征(体质量、肛温)、物质代谢(乳酸LA、丙酮酸PA、甘油三酯TG)、能量代谢(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH、SDH、肝糖原)、甲状腺功能轴(T3、T4、TSH、TRH)、环核苷酸水平(环磷酸腺苷c AMP、环磷酸鸟苷c GMP、c AMP/c GMP值)17种指标来考察黄柏炮制前后寒热药性的变化情况。结果:生黄柏(高、低剂量)和盐黄柏(高、低剂量)能不同程度的改变大鼠体质量、肛温、T3、T4、TSH、TRH、环核苷酸水平及物质与能量代谢指标;盐黄柏(高、低剂量)常较生黄柏(高、低剂量)作用更加显著,酒黄柏(高、低剂量)对这17种指标的改变作用大多不明显。结论:黄柏盐制后寒性增强,酒制后寒性减弱。

UPLC-MS/MS法测定不同温度定向炮制黄芪中8种苷类和4种苷元成分的含量

目的:建立测定黄芪中8种苷类(黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪异黄烷苷、黄芪紫檀烷苷)及4种苷元(毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪异黄烷、黄芪紫檀素)成分含量的方法,并考察不同炮制温度对上述12种成分含量的影响。方法:分别以生黄芪和不同温度(120、140、160、180、200℃)烘制后的黄芪为样品,采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定其中12种成分的含量。色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3,流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(梯度洗脱),流速为0.5 mL/min,柱温为30℃,检测波长为260 nm,进样量为2μL。采用电喷雾离子源,在正离子模式下进行监测扫描,扫描范围为质菏比50~1500,毛细管电压为2000 V,离子源温度为100℃,脱溶剂温度为400℃,雾化气(N2)流速为40 L/h,脱溶剂气(N2)流速为800 L/h,碰撞能量为20~30 V,数据采集速率为0.5 s/scan。结果:黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、黄芪异黄烷苷、黄芪异黄烷、黄芪紫檀烷苷、黄芪紫檀素的检测质量线性范围分别为0.00116~0.2320、0.000276~0.0552、0.00022~0.0440、0.000225~0.0450、0.000734~0.5870、0.00117~0.2340、0.000742~0.1480、0.00130~0.260、0.00398~0.7950、0.000476~0.4760、0.00189~0.3780、0.000336~0.3360μg(R2均不低于0.9992);检测限分别为6.2×10-6、4.8×10-6、3.8×10-6、3.4×10-6、5.8×10-6、4.8×10-6、4.2×10-6、3.2×10-6、5.8×10-6、2.6×10-6、4.2×10-6、6.4×10-6μg;定量限分别为12.6×10-6、16.2×10-6、14.4×10-6、14.8×10-6、18.8×10-6、16.4×10-6、15.4×10-6、10.8×10-6、20.2×10-6、12.4×10-6、14.6×10-6、23.4×10-6μg;精密度、稳定性(24 h)、重复性试验的RSD均小于3.0%(n=6);平均加样回收率分别为99.1%、100.2%、98.7%、101.9%、98.6%、102.1%、99.2%、100.3%、98.7%、99.2%、99.3%、100.8%,RSD分别为1.9%、2.2%、2.4%、1.8%、2.1%、1.7%、2.3%、1.9%、2.4%、1.8%、2.2%、1.9%(n=6)。含量测定结果显示,黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量随着烘制温度的升高而逐渐降低,黄芪皂苷Ⅳ的含量随着温度的升高而逐渐升高;黄酮苷类成分毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪异黄烷苷、黄芪紫檀烷苷的含量均随着烘制温度的升高而降低,而对应的苷元成分毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪紫檀素的含量均随着烘制温度的升高而先升高后降低;黄芪异黄烷的含量随着烘制温度的升高而降低。结论:所建立的UPLC-MS/MS法可用于黄芪中12种成分含量的测定;黄芪经不同温度炮制后,苷类成分含量总体呈降低趋势,苷元成分含量总体呈升高趋势。

黄柏不同炮制品对甲亢型肾阴虚模型大鼠甲状腺和肾上腺皮质功能的影响

目的:比较生黄柏、酒黄柏和盐黄柏对甲亢型肾阴虚模型大鼠甲状腺和肾上腺皮质功能的影响。方法:将88只大鼠随机分为空白组、模型组、黄酒组、盐水组、阳性组(六味地黄丸,0.2 g/kg,以生药计)以及生黄柏、酒黄柏、盐黄柏的高、低剂量组(剂量均为9.519、1.058 g/kg,以生药计),每组8只。除空白组外,其余各组大鼠均ig左旋甲状腺素钠复制肾阴虚模型;于造模同时各给药组大鼠ig相应药物,其余组大鼠ig等体积相应溶液,每天1次,连续3周。末次给药后测定大鼠体质量、24 h尿量、脏器(胸腺、脾)指数,并测定血清中游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、抗利尿激素(AVP)、环磷酸腺苷(c AMP)、环磷酸鸟苷(c GMP)水平及尿液中17-羟皮质类甾醇(17-OHCS)水平,并计算c AMP/c GMP比值。结果:与空白组比较,模型组大鼠体质量、24 h尿量、脏器(胸腺、脾)指数均明显降低;血清中FT3、FT4、AVP、c AMP水平、c AMP/c GMP比值及尿液中17-OHCS水平明显升高,血清中c GMP水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。除酒黄柏低剂量组大鼠体质量和酒黄柏高、低剂量组大鼠血清中c GMP水平外,阳性组及生、酒、盐黄柏的高、低剂量组大鼠上述指标较模型组均明显改善(P<0.05或P<0.01),改善程度大小依次为盐黄柏组>生黄柏组>酒黄柏组;且盐黄柏高剂量组大鼠血清中c AMP水平和c AMP/c GMP比值及盐黄柏高、低剂量组尿液中17-OHCS水平均明显低于同剂量生黄柏组(P<0.05)。结论:黄柏对甲亢型肾阴虚模型大鼠甲状腺和肾上腺皮质功能均有一定的改善作用,且盐制品作用增强,而酒制品作用减弱,提示黄柏给盐制后其滋阴效果有所增强。

HPLC异硫氰酸苯酯柱前衍生化测定黄柏及其不同炮制品中17种氨基酸的含量

目的:研究黄柏炮制前后17种氨基酸的含量变化情况进而评价黄柏炮制前后的寒热药性的变化。方法:采用反相高效液相色潽法,以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生化试剂衍生后进行HPLC分析。采用C18(250mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,柱温为43℃;流动相A为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液(以醋酸调p H 6.5)-乙腈(93∶7),流动相B为乙腈-水(4∶1),梯度洗脱,流速为1.0 m L·min-1;检测波长为254 nm。结果:17种氨基酸浓度在线性范围内呈良好的线性关系(r=0.996 8~0.999 5);回收率在96.7%~104.26%之间,RSD均小于3.0%。结论:本方法灵敏、准确,具有良好的重复性和稳定性,可用于黄柏中氨基酸的检测。

星点设计-效应面法优化盐巴戟炮制工艺

目的优化盐巴戟的炮制工艺。方法在单因素试验基础上,以加水量、闷润时间、蒸制时间为自变量,耐斯糖、甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷的综合评分为评价指标,通过星点设计-效应面法优选盐巴戟的炮制工艺。结果最佳炮制工艺为加水1.05倍,闷润5.48 h,蒸制2.90 h(100 g巴戟肉加盐1.5 g),测量值和预测值之间的相对误差为3.04%。结论该方法得到的炮制参数准确,重复性好,有一定实际意义。

黄柏系统炮制学研究

目的:探究黄柏在一系列的炮制工序中指标性成分的变化情况。方法:采用高效液相色谱法测定采自同一植株的黄柏药材在不同的炮制工序下黄柏碱和小檗碱的含量变化情况。其高效液相色谱的检测条件为Ecosil C_(18)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸水(50∶50)(每100mL0.1%磷酸水加十二烷基硫酸钠0.4g);检测波长:284nm;体积流量:1mL/min;柱温:35℃。结果:黄柏在软化和盐炙过程中,其生物碱的含量均有所降低,且软化过程降低得最多;在代表方剂中,盐炙品入药较之生品入药,其检测出的指标成分更多。结论:黄柏饮片加工应该注意炮制过程中的成分流失,并尽可能做到提高黄柏饮片中指标性成分的含量。

巴戟天不同炮制品对肾阳虚不育大鼠改善作用研究

目的:观察巴戟天不同炮制品对于用腺嘌呤灌胃诱导的肾阳虚不育大鼠的比较研究,综合评价巴戟天不同炮制品中盐巴戟对生殖功能低下大鼠的改善作用。方法:使用腺嘌呤复制大鼠的肾阳虚模型,用ELISA法测定大鼠血清中促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)、促性腺释放激素(GnRh)、雌二醇(E2)、肌酐(Cr)的含量,计算肾脏、睾丸、精囊腺脏器系数。用HE染色法观察睾丸和肾脏的组织病理形态,免疫组化染色法(SABC法)测定大鼠睾丸中细胞色素P-19(CYP19)和芳香化酶P450(P450arom)蛋白表达。结果:CYP19和P450arom在大鼠睾丸间质细胞质中均有表达,巴戟天不同炮制品均能使P450arom、CYP19蛋白表达得到不同程度增高与降低。在血清激素水平方面,各给药组均能提高FSH、LH、T、GnRh的含量,降低E2、Cr的含量,其中以盐巴戟的治疗效果最为明显。结论:巴戟天具有较好的补肾壮阳作用,对生殖功能低下的大鼠具有改善作用,且不同炮制品具有显著差异,其中盐巴戟的疗效最佳。本实验结果可为临床合理使用巴戟天不同炮制品提供科学依据。

UPLC-QQQ-MS法测定巴戟天炮制前后10种成分的含量

目的:建立不同来源巴戟天生品与炮制品中水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、5-羟甲基糠醛、甲基异茜草素、甲基异茜草素-1-甲醚、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的含量测定方法。方法:采用UPLC-QQQ-MS技术,色谱柱为Ultimate UPLC AQ-C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)、ACQUITY UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈,梯度洗脱;流速:0.3 mL/min;进样量:1μL;柱温:40℃;ESI离子源正负离子同时扫描,多反应监测模式(MRM)检测。结果:10种成分在相应的进样量范围内线性关系良好,R2≥0.9990,平均加样回收率为97.80%~100.13%,RSD均小于2.00%。结论:该方法快速、准确,可用于巴戟天生品及炮制品的质量评价,为优化巴戟天的炮制工艺提供一定的科学依据。

中药寡糖生物活性及炮制过程中化学反应研究概况

中药寡糖来源及分布广泛,以其特殊的生物活性和化学性质,在营养保健、疾病防治等方面有巨大潜力,其成分研究逐渐增多,并不断拓展研究及应用范围。中药寡糖可通过天然提取、降解和人工合成方法获取,其中以层析法为代表的天然提取方法最为适用。中药寡糖具有不同的基团和连接方式,其结构复杂,在炮制过程中也有不同化学反应。本文从中药寡糖的分离、生物活性及炮制过程中化学反应等方面综述该领域研究概况。

层次分析法结合Box-Behnken响应面法优化炙黄芪炒制工艺

目的 优选传统炒制黄芪的炮制工艺。方法 以炙黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、黄芪皂苷Ⅰ、水溶性浸出物的含量及外观性状评分为考察指标,以炒制温度、炒制时间、蜜水比3个因素为考察因素,采用层次分析法(Analytic Hierarchy Process, AHP)结合设计-响应面法(Box-Behnken)考察对炙黄芪炮制工艺的影响,找出最佳炮制工艺,并进行验证实验。结果 炙黄芪的最佳炮制工艺是炒制温度139.41℃、炒制时间6.040 min、炼蜜与水的比例为1∶0.680 2。结论 该炮制工艺参数稳定可行,可为炙黄芪规范化生产提供依据。

桑螵蛸生、制品对肾阳虚大鼠的补肾助阳作用比较

目的:比较桑螵蛸生品、制品的补肾助阳作用,并探究最佳药用部位。方法:将大鼠随机分为正常对照组、模型组、右归丸组及桑螵蛸生品组、盐炒组、蒸品组、生品虫卵组、生品卵壳组、盐炒虫卵组、盐炒卵壳组、蒸品虫卵组、蒸品卵壳组。氢化可的松造成肾阳虚模型,治疗4 w后,通过比较下丘脑一氧化氮(NO)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺指数、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、肾上腺指数、肾脏指数、肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)、17-羟皮质类固醇(17-OH)、皮质醇(CORT)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、体质量、饮水量、体温等指标的影响,比较桑螵蛸生品和制品补肾壮阳作用的差异。结果:治疗4 w之后,桑螵蛸各给药组均能提高肾阳虚大鼠的甲状腺指数、肾上腺指数及TSH、T3、T4、EPI、NE、17-OH、CORT、T含量,增加体质量和体温,并能降低NO、E2含量和肾脏指数,减小饮水量,其中盐炒组和盐炒虫卵组效果最为显著。结论:桑螵蛸经炮制后补肾助阳作用增强,盐炒品>蒸品>生品。盐炒品的虫卵是桑螵蛸补肾助阳的主要药用部位,其药效是通过增强下丘脑-垂体-甲状腺轴、肾上腺轴、性腺轴的功能来实现的。

桑螵蛸生制品对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响

目的:比较桑螵蛸生品、制品对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响。方法:对比桑螵蛸生品、制品对巨噬细胞的增殖率和吞噬作用,并测定巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)含量;经皮注射环磷酰胺建立小鼠免疫低下模型,测定小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、免疫球蛋白M(Ig M)、免疫球蛋白G(Ig G)含量和胸腺、脾脏指数,体内外实验结合,比较桑螵蛸生品、制品对免疫功能的影响。经皮注射四氧嘧啶造成小鼠氧化损伤模型,测定小鼠血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,并采用蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测各组小鼠肝脏组织中SOD的表达,比较桑螵蛸生品、制品对氧化损伤的保护作用。结果:桑螵蛸各给药组均能促进巨噬细胞的增殖,并能提高其吞噬能力,促进巨噬细胞TNF-α和NO的释放,升高免疫低下小鼠血清中IL-2、IL-4、Ig M、Ig G含量和胸腺指数、脾脏指数。提高氧化损伤小鼠血清MDA、SOD、GSH-Px的含量,上调SOD蛋白表达水平。结论:桑螵蛸生品和炮制品均能增强免疫功能,并对氧化损伤具有一定的保护作用,生品的效果优于炮制品。

猪牛羊胆汁及其制成的胆南星药效作用对比研究

目的:比较猪、牛、羊胆汁及其制成的胆南星抗惊厥和解热作用,分析其作用机制。方法:分别建立幼鼠高热惊厥模型和大鼠发热模型。ELISA法测定惊厥幼鼠血清NSE、S100B、脑组织Glu、Asp、THF-α、IL-Iβ、海马组织Caspase-3活性和GABA、Glu的含量及发热大鼠肝脏组织SDH、GLYCOGEN的代谢情况、下丘脑组织PGE_(2)、cAMP、血清IL-10、IL-6、IL-1β的含量及肛温变化情况。结果:与高热惊厥模型幼鼠相比,给药组均能够明显降低由高热引起的惊厥发生率,延长惊厥潜伏期,缩短惊厥持续时间,升高海马组织GABA含量,降低脑组织Glu、Asp、TNF-α、IL-1β、海马组织Glu的含量及Caspase-3活性及血清NSE、S100B的含量(P<0.05,P<0.01,猪胆汁及其制成的胆南星组除外);与发热模型大鼠相比,各给药组能够显著降低大鼠肛温及血清IL-10、IL-6、IL-1β、肝组织SDH代谢、下丘脑组织PGE_(2)和cAMP的含量,增加肝组织GLYCOGEN代谢含量(P<0.05,P<0.01;猪胆汁组除外)。不论是抗惊厥还是清热实验,牛胆汁和羊胆汁评价指标多优于猪胆汁,胆南星(牛胆汁制、羊胆汁制)在大多数评价指标方面优于胆南星(猪胆汁制),且部分具有显著性差异。结论:猪、牛、羊胆汁及其制成的胆南星均有抗惊厥和清热作用,但胆南星(牛胆汁制、羊胆汁制)治疗效果略优于胆南星(猪胆汁制),符合“牛胆汁制去燥烈而清润”的传统理论。

巴戟天微型饮片工艺优选

目的优选巴戟天微型饮片切制工艺参数,探讨其是否适用于不同产地来源的巴戟天。方法以蒸制时间、饮片长度、饮片厚度、烘干温度为影响因素,以水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸、甲基异茜草素-1-甲醚、甲基异茜草素、耐斯糖的含量及出膏率、休止角为评价指标,采用正交试验优选巴戟天微型饮片切制工艺,并建立不同产地来源巴戟天微型饮片HPLC指纹图谱。结果巴戟天微型饮片最佳切制工艺为:常压蒸制软化30 min,切片长度3 mm,切片宽度1～2 mm,40℃烘干。结论巴戟天微型饮片软化切制工艺简单易行,具有良好的适用性。

甘草微型饮片切制工艺及UPLC指纹图谱

目的优化甘草微型饮片切制工艺,建立其UPLC指纹图谱。方法以流动性、出膏率以及甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草次酸、异甘草素、查耳酮含有量为评价指标,软化时间、饮片厚度、饮片粒径、干燥温度为影响因素,正交试验优化切制工艺。甘草70%乙醇提取物的分析采用BEH C_(18)色谱柱(2. 1 mm×50 mm,1. 7μm);流动相乙腈-0. 1%磷酸,梯度洗脱;体积流量0. 3 mL/min;柱温25℃;检测波长237 nm。结果最佳工艺为粒径0. 5～0. 9 mm,厚度1 mm,软化时间1 h,干燥温度50℃。10批样品UPLC指纹图谱中有25个共有峰,相似度均大于0. 9。6种成分在各自范围内线性关系良好(R^2>0. 999 0),平均加样回收率为99. 4%～102. 5%,RSD 0. 29%～1. 9%。结论该方法准确稳定,重复性好,可用于甘草微型饮片的质量控制。

多指标综合评价结合层次分析法优化酸枣仁炒制工艺

目的采用正交设计综合加权评分结合层次分析法优化酸枣仁的炒制工艺。方法采用单因素实验优化炒制时间和炒制温度,然后以酸枣仁炒制工艺中的关键因素炒制时间和炒制温度为因素,以斯皮诺素、6-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸含有量进行综合加权评分为评价指标,结合层次分析法,优化酸枣仁的炒制工艺。结果最佳炒制工艺为炒制温度130~140℃,炒制时间60 s。同时发现10批不同产地酸枣仁炒制后,斯皮诺素、6-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、白桦脂酸含有量均有所增加。结论该方法稳定可行,可用于炒制酸枣仁。

巴戟天生、制品对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

目的:考察巴戟天生、制品对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。方法:采用环磷酰胺制备免疫功能低下小鼠模型,通过检测血清IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平、红细胞和白细胞数量、胸腺及脾脏指数、T淋巴细胞亚群等指标,并观察小鼠胸腺病理切片,探讨巴戟天生、制品对小鼠免疫功能的调节作用。结果:与模型组相比,给药组中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ的水平、胸腺和脾脏指数、血液红细胞和白细胞数量、CD4^+/CD8^+均有不同程度的升高(P<0.05或P<0.01),且盐巴戟天组各指标恢复程度均优于巴戟肉组。结论:巴戟天生、制品均能显著改善免疫低下小鼠的免疫功能,且盐制后巴戟天的作用增强,这可为进一步研究治疗免疫抑制药物提供新思路。

肉苁蓉微型饮片切制工艺优化

目的优化肉苁蓉饮片的切制工艺。方法采用正交试验的方法,以饮片截面直径、厚度、软化时间、干燥温度为影响因素,休止角、浸出物、毛蕊花糖苷、松果菊苷、异类叶升麻苷、含有量为评价指标,优化饮片切制工艺。结果最佳切制工艺为饮片截面直径3～4 mm,厚度1～2 mm,软化时间2 h,干燥温度70℃。结论该方法合理可行,适用于肉苁蓉饮片的切制及应用。

巴戟天盐蒸过程中梅拉德反应及其产物的研究

目的:观察巴戟天盐蒸不同时间对水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛含量的动态变化。方法:采用HPLC梯度洗脱的方法,测定巴戟天盐蒸过程中的水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和5-羟甲基糠醛的含量。同时对蒸制过程中的p H值、吸光度等进行监测。结果:随着巴戟天盐蒸时间的不断延长,环烯醚萜苷类成分水晶兰苷的含量逐渐下降,去乙酰车叶草苷酸的含量变化不大;巴戟天盐蒸后新产生的5-羟甲基糠醛的含量逐渐升高。结论:巴戟天在盐蒸过程中可能发生了美拉德反应。