中医体质学说在冠心病血瘀证中的应用

从中医体质学说的角度,论述了体质与中医病证的关系,认为体质是决定疾病产生的重要因素,体质能影响证候类型、性质及转归从化.同时从防治层面结合系统生物学阐述了体质学说对冠心病血瘀证研究的影响及前景。

心血瘀阻证心肌微环境基质金属蛋白酶-2,9表达的实验研究

目的:观察基质金属蛋白酶-2、9在心血瘀阻证心肌微环境的变化。方法:建立大鼠急性心梗心血瘀阻证模型,分为假手术组、健康对照组、心虚瘀阻证组,然后用ELISA方法观测其基质金属蛋白酶2、9的表达。结果:基质金属蛋白酶2血瘀阻证表达高于健康对照和假手术组(P<0.05),基质金属蛋白酶9三组间均有差异,其中心血瘀阻证组最高,其次为假手术组、健康对照组(P<0.05)。结论:基质金属蛋白酶-2、9参与心血瘀阻证心肌微环境的变化,是中医证候本质的物质学基础。

lncRNA SNHG1调控铁死亡减轻HIV-1 gp120 V3环所致小胶质细胞炎症的分子机制研究

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)SNHG1调控铁死亡改善HIV-1 gp120 V3环致CHME-5人源小胶质细胞炎症的分子机制。方法:体外培养CHME-5人源小胶质细胞,设立空白组、随机肽段组、HIV-1 gp120V3环组(HIV-1 gp120组)、HIV-1 gp120+shCon组、HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组、HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+ferrostatin-1(Fer-1;铁死亡抑制剂)组和HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+EX527(Sirt1抑制剂)组。随机肽段和gp120 V3环分别处理正常CHME-5细胞24 h;抑制剂预处理SNHG1 sh2细胞2 h后,gp120 V3环处理24 h。ELISA法检测细胞上清中炎症因子水平;Western blot法检测铁死亡相关蛋白[溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)]、Sirt1和p53蛋白表达水平;酶标仪检测细胞内亚铁离子(Fe^(2+))和丙二醛(MDA)含量。结果:(1)ELISA结果显示:较空白组,HIV-1 gp120组炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β表达水平显著提高(P<0.05);较HIV-1 gp120组,HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组炎症因子表达水平显著降低(P<0.05);较HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组,HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+Fer-1组炎症因子表达水平显著降低(P<0.05),HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+EX527组炎症因子表达水平显著升高(P<0.01)。(2)Western blot结果显示:较空白组,HIV-1 gp120组铁死亡相关蛋白SLC7A11和GPX4表达水平显著下调(P<0.01);较HIV-1 gp120组,HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组SLC7A11和GPX4表达水平显著上调(P<0.01);较HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组,HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+Fer-1组SLC7A11和GPX4表达水平明显上调(P<0.05),HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+EX527组SLC7A11和GPX4表达水平显著下调(P<0.01),p53表达水平显著上调(P<0.05)。(3)较空白组,HIV-1 gp120组Fe^(2+)和MDA含量显著提高(P<0.05);较HIV-1 HIV-1 gp120组,HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组Fe^(2+)和MDA含量显著降低(P<0.01);较HIV-1 gp120+SNHG1 sh2组,HIV-1gp120+SNHG1 sh2+Fer-1组Fe^(2+)和MDA含量显著降低(P<0.05),HIV-1 gp120+SNHG1 sh2+EX527组Fe^(2+)和MDA含量显著提高(P<0.05)。结论:敲减SNHG1可减轻HIV-1 gp120 V3环介导的小胶质细胞炎症反应,其机制可能是通过Sirt1/p53信号通路调控铁死亡相关信号分子实现的。

替普瑞酮通过E3泛素连接酶CHIP减轻LPS引起的心肌炎症反应和心功能障碍

目的:探究替普瑞酮又称香叶基香叶基丙酮,GGA)对脂多糖(LPS)诱导的心功能障碍的治疗作用及机制。方法:(1)取8周龄C57BL/6雄性野生型小鼠和热休克蛋白70(HSP70)羧基末端相互作用蛋白(CHIP)基因敲除小鼠,随机分为对照组、LPS组、LPS+GGA组和GGA组,每组8只。用腹腔注射LPS(25 mg/kg)的方法建立模型,于LPS刺激后1 h给予小鼠腹腔注射GGA(100 mg/kg)。利用小动物超声系统评估小鼠心脏功能;采集各组小鼠血清,检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;HE染色观察病理学改变;ELISA检测心脏组织中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的水平;Western blot检测各组心脏组织HSP70、CHIP、核转运蛋白α2(KPNA2)、髓过氧化物酶(MPO)、血管细胞黏附分子(VCAM)和细胞间黏附分子(ICAM)的蛋白表达以及细胞核NF-κB的水平。(2)利用小鼠心肌细胞HL-1,建立LPS刺激的离体细胞炎症模型。ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-6的水平;Western blot检测心肌细胞中HSP70、CHIP和KPNA2蛋白表达;免疫荧光染色观察细胞核NF-κB的表达。结果:(1)GGA有效改善LPS刺激小鼠的心脏功能,显著提高射血分数和左室短轴缩短率(P<0.01),减少血清CK-MB和LDH含量(P<0.01),减轻心肌损伤。(2)GGA显著减少LPS引起的TNF-α和IL-6炎症因子的释放(P<0.01),以及NF-κB的入核,降低心肌组织中KPNA2、MPO、VCAM和ICAM蛋白表达,增加心肌组织和细胞HSP70的水平(P<0.01)。(3)在CHIP基因敲除的心肌细胞和小鼠中,GGA不能抑制LPS引起的炎症反应,失去了改善LPS刺激小鼠心脏功能的作用。结论:GGA能够减轻LPS引起的心功能障碍,其作用机制与升高HSP70的表达,促进CHIP的活化,减少NF-κB的入核,抑制炎症因子的释放有关。CHIP的敲除使GGA丧失了减轻LPS诱导的炎症反应和心肌损伤的作用。

Aβ42寡聚体对突触内外谷氨酸受体表达的影响

目的:通过体内外实验探讨阿尔茨海默病关键发病分子β-淀粉样蛋白42寡聚体(Aβ42Os)作用下离子型谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)亚基(NR2A、NR2B和NR1)和代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)在突触内外的表达分布变化。方法:(1)用不同浓度的Aβ42Os处理乳小鼠原代神经元,Western blot和免疫荧光染色检测原代神经元中mGluR5和NMDAR的表达和分布情况。(2)在C57BL/6小鼠侧脑室立体定位注射不同浓度的Aβ42Os,Western blot检测海马组织中mGluR5和NMDAR在突触内外的蛋白水平,以及mGluR5下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/AKT)信号通路相关蛋白、钙信号下游通路相关蛋白和突触相关蛋白的表达。结果:(1)高浓度Aβ42Os处理原代小鼠神经元增加mGluR5表达(P<0.01),减少NR2A、NR2B和NR1表达(P<0.01);引起mGluR5膜表面聚集,而使NR2A、NR2B和NR1膜表面表达分布减少。(2)高浓度Aβ42Os引起小鼠海马组织中突触mGluR5表达增加(P<0.01),NR2A(P<0.05)和NR2B(P<0.01)表达减少,突触外NR2B表达增加(P<0.01);抑制PI3K表达及AKT和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化,过度激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CaMKIIα);引起突触后致密蛋白95、亲棘蛋白(spinophilin)、突触小泡蛋白(synaptophysin)和微管相关蛋白2表达减少(P<0.01)。结论:(1)高浓度Aβ42Os引起神经元突触mGluR5过度聚集,NR2A、NR2B和NR1表达减少,而突触外NR2B表达增加。(2)高浓度Aβ42Os抑制PI3K/AKT和ERK信号通路,过度激活CaMKIIα通路,损伤突触结构。

基于血清药理学的肝龙胶囊含药血清制备方法的初步探究

目的:利用血清药理学,探究用于肝细胞脂肪变性药效观察的肝龙胶囊(GLC)含药血清的最佳取血时间和含药血清体积分数。方法:C57BL/6J小鼠60只,灌胃GLC(90 mg/kg),每日两次,连续7 d,分别在末次给药0.5、1、2和4 h心脏采血,收集血清。对照组小鼠灌胃同体积的生理盐水。LC-MS/MS技术检测空白血清及不同采血时间含药血清肌苷含量,确定最佳采血时间。应用0%、1%、3%和10%GLC血清处理棕榈酸(PA)刺激的小鼠肝细胞NCTC1469,尼罗红染色检测细胞脂滴生成,RT-qPCR检测细胞内脂肪酸生成基因Fabp1和Scd1,及脂肪酸β-氧化基因Pparα的表达。结果:(1) LC-MS/MS检测发现在末次给药2 h后血清中肌苷浓度最高。(2)尼罗红染色显示GLC血清对PA诱导的肝细胞脂质积累具有剂量依赖性的减少趋势。(3) 1%和3%和10%GLC血清处理均能显著下调PA刺激的肝细胞内Fabp1和Scd1的表达,且具有剂量依赖性的减少趋势;1%、3%和10%GLC血清处理均能显著上调PA刺激的肝细胞内Pparα的表达,且具有剂量依赖性的增加趋势。结论:小鼠给药后2 h的10%GLC血清是用于肝细胞脂肪变性药效观察的最佳血清干预浓度。

不同类型音乐对小鼠空间学习记忆能力及机制的初步研究

目的:观察不同类型音乐对小鼠空间学习记忆能力影响,并对其机制进行初步探讨。方法:健康昆明成年小白鼠57只随机分成3组,空白对照组:不予任何特殊声音刺激,莫扎特音乐组和梁祝音乐组分别播放相应曲目,每天用相应音乐干预2 h,连续4 d。第5 d后进行Morris水迷宫测试,测试期间保持音乐刺激不变,放完音乐后测试潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间,实验结束后处死小鼠取脑组织并匀浆,检测乙酰胆碱酯酶活性(TchE)和单胺氧化酶活性(MAO)。结果:梁祝音乐组与对照组、莫扎特音乐组相比,小鼠逃避潜伏期缩短,经过平台次数和平台象限停留时间增加(P<0.05);而莫扎特音乐组逃避潜伏期,经过平台次数和平台象限停留时间虽有缩短,但与其它两组均无显著性差异。梁祝音乐组与对照组、莫扎特音乐组相比,小鼠脑组织TchE和MAO活性均明显减少(P<0.05),而莫扎特音乐组的TchE和MAO与其它两组比较差别不大。结论:《梁祝小提琴协奏曲》能明显提高昆明小鼠的空间记忆能力,可能与该音乐引起的脑组织的乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性降低,减少脑组织神经递质的降解,增加其浓度,促进学习记忆能力有关;而在本研究中《莫扎特D大调小提琴协奏曲》效果不明显。

脓毒症小鼠死亡高发期心功能变化的动态观察

目的:研究脓毒症小鼠死亡高发期心功能的动态变化。方法:应用高分辨小动物超声成像系统对正常雄性昆明小鼠先行超声心动图检查(0h)后行盲肠结扎穿孔术,术后分5个时点(12h,24h,36h,48h,168h)对小鼠进行超声心动图检查,168h(7d)仍存活的小鼠视为存活动物,每只小鼠均进行编号,确保对其进行连续观察。结果:小鼠在盲肠结扎穿孔术早期即出现回心血量显著减少,左室舒张末期容积在CLP术后24h达最低点,较术前下降了46%。小鼠在脓毒症的刺激下心脏功能出现明显的代偿性改变,尤其以收缩功能最强,舒张功能的代偿弱于收缩功能,CLP术后24h,射血分数和短轴缩短率较术前分别增加了27%和39%,E/A比值和E峰减速时间较术前减少了30%和25%。结论:强大的心脏代偿功能是脓毒症小鼠得以存活的重要原因之一。重视心脏代偿功能尤其是舒张功能的保护对提高生存率有重要意义。

钩藤碱降低内毒素血症小鼠死亡率的机制研究

目的:观察钩藤碱对内毒素血症小鼠死亡率及器宫损伤的影响,并探讨其作用机制。方法:雄性小鼠随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、钩藤碱(Rhy)防治组和Rhy对照组,分别予以生理盐水、Rhy皮下注射,1time/d,连续3d,第3d皮下注射后1h,腹腔注射生理盐水或LPS(20mg/kg)。观察各组小鼠的死亡率,肺、小肠组织病理改变;测定注射LPS后12h各组肺湿/干重比值(W/D)及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的水平;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-10(IL-10)的含量,用硝酸还原酶法试剂盒测定血清一氧化氮(NO)的含量。进一步复制盲肠结扎穿孔的脓毒症模型,观察钩藤碱对脓毒症小鼠生存率的影响。结果:LPS攻击后24h小鼠的生存率明显低于对照组,8、16mg/kg的钩藤碱防治组小鼠生存率高于LPS组。但钩藤碱并不能降低CLP小鼠的死亡率,而且,8mg/kg钩藤碱治疗组小鼠的死亡率反而高于CLP小鼠的死亡率。LPS攻击后12h病理检查发现LPS组小鼠肺及小肠组织均有严重的炎症表现;肺W/D、血清ALT、AST、BUN、Cr水平显著高于对照组;LPS攻击后2h血清TNF-α、IL-1β及IL-10含量及8h血清NO水平显著高于对照组。LPS攻击后12h,Rhy防治组肺及小肠组织损伤无明显改善;肺W/D、血清ALT、AST、BUN、Cr水平与LPS组比较无显著差异;LPS攻击后2h血清TNF-α水平显著低于LPS组,但2h血清IL-1β及IL-10含量及8h血清NO水平与LPS组比较无显著差异。结论:钩藤碱能降低内毒素血症小鼠的死亡率,但不能降低脓毒症小鼠的死亡率,抑制TNF-α的生成可能是钩藤碱降低内毒素血症小鼠死亡率的机制之一。

七氟醚预处理对LPS诱导的小鼠心功能障碍的影响

目的:观察七氟醚(Sevo)预处理对脂多糖(LPS)诱导的心功能障碍的影响并初步探讨其作用机制。方法:40只雄性BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(control)、LPS组、Sevo组和Sevo+LPS组。分别用2%Sevo(以纯氧为载气)或纯氧预处理30 min,洗脱10 min后,腹腔注射LPS 18 mg/kg或等量生理盐水。于腹腔注射后12 h,通过高分辨小动物超声系统检测心功能,结束后立即采血并处死小鼠,用生化分析仪检测血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性;留取小鼠心脏标本,制备石蜡切片,进行HE染色后在光学显微镜上观察各组小鼠心脏的组织结构变化,分别用硝酸还原酶法和比色法检测小鼠心肌组织中一氧化氮(NO)的含量和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。结果:LPS腹腔注射后12 h,超声检测显示LPS组小鼠左心室舒张末期容积(LVEDV)增大(P<0.05),每搏输出量(SV)、心输出量(CO)和射血分数(EF)降低(P<0.05);血清LDH和CK-MB水平升高(P<0.05);病理切片见心肌明显病变。Sevo+LPS组与LPS组比较,LVEDV减小(P<0.05),SV、CO和EF增加(P<0.05),LDH和CK-MB水平显著降低(P<0.05),心肌组织的病理损伤减轻。LPS引起心肌组织中NO含量和iNOS活性升高(P<0.05),Sevo对此有抑制作用(P<0.05)。结论:Sevo预处理减轻LPS引起的心肌损伤和心功能障碍,其机制可能与其抑制心肌iNOS活性,减少NO的生成有关。

心血瘀阻证微环境对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察心血瘀阻证微环境(Heart-Blood Stagnation Syndrome Microenvirment)对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌样细胞分化的影响。方法采用全骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,以流式细胞仪检测细胞表面标志;细胞培养基中加入心血瘀阻证大鼠坏死心肌组织和血清的方法模拟心血瘀阻证微环境;四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察心血瘀阻证微环境对MSCs增值率从而选择最大有效浓度;第4代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化;相差显微镜、免疫组化及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果鉴定心肌细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD11b和CD45阳性细胞率小于2%,CD90阳性率达到98%以上;疫细胞化学染色显示心血瘀阻证微环境组、5-aza组和健康大鼠微环境组中Desmin和MHC呈阳性,其中心血瘀阻证微环境组表达高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组未见表达;RT-PCR结果显示心血瘀阻证微环境组、5-aza组和健康大鼠微环境组细胞肌钙蛋白(cTnI)和心脏早发育基因GATA-4 mRNA表达水平高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),心血瘀阻证微环境组显著高于5-aza组和健康大鼠微环境组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论体外模拟大鼠心血瘀阻证微环境能诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。

甘氨酸受体在甘氨酸抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究

目的:探讨甘氨酸受体在心脏保护中的作用及甘氨酸受体的性质。方法:利用原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞建立心肌缺氧/复氧(A/R)模型,并用甘氨酸受体阻断法和消除细胞外氯离子法,测定各组培养心肌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)的含量、钙离子浓度和心肌细胞凋亡率。结果:A/R组用甘氨酸处理后SOD活性、NO含量升高,MDA含量、[Ca2+]i、细胞凋亡率降低,与A/R组比较显著差异。分别用甘氨酸受体阻断剂士的宁和消除细胞外氯离子处理后,甘氨酸的上述保护作用明显减弱,与A/R组比较无显著差异。结论:甘氨酸能抑制缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的自由基生成、抑制钙超载,减轻心肌细胞的凋亡并增加细胞内SOD等保护蛋白和NO的合成而发挥细胞保护作用。甘氨酸的细胞保护作用可能是通过甘氨酸受体发挥作用的,甘氨酸受体的本质可能是甘氨酸门控氯离子通道。

中药四毒清抑制LPS性肾脏损伤的机制研究

目的:研究中药复方四毒清防治内毒素性肾功能衰竭的作用机制。方法:将小鼠随机分成对照组、LPS组、四毒清防治组和四毒清组,用水(0.2mL/10gBW)或四毒清(1000g/L,0.2mL/10gBW)灌胃3d,每天2次,第3d灌胃后2h,腹腔注射LPS(30mg/kg,0.2mL/10gBW)或生理盐水(0.2mL/10gBW),腹腔注射后2h,再用水或四毒清(0.2mL/10g)灌胃1次。测定各组小鼠血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量,观察肾脏超微结构,肾组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化,并用半定量RT-PCR方法测定肾组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达。结果:LPS引起小鼠血清Cr和BUN含量明显升高,肾脏近曲小管出现明显病理改变。四毒清有效降低LPS攻击小鼠血清Cr和BUN的含量,明显减轻近曲小管的损伤。LPS组小鼠肾组织MDA含量和ICAM-1mRNA的表达显著高于对照组,而四毒清防治组肾组织MDA含量和ICAM-1mRNA的表达明显低于LPS组,四毒清处理能显著升高肾组织SOD的活性。结论:中药四毒清防治内毒素性肾功能衰竭的作用机制与其升高肾组织SOD的活性、减轻肾组织氧化损伤并抑制肾脏ICAM-1mRNA的表达有关。

疏肝健脾方对NASH大鼠肝组织IKKβmRNA和蛋白表达的影响

目的:探讨疏肝健脾方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝组织核因子κB(NF-κB)抑制蛋白激酶β(IKKβ)mRNA和蛋白表达的影响。方法:采用高脂饲料喂养建立NASH大鼠实验模型,在施以造模因素的同时各药物干预组大鼠分别灌服疏肝方(柴胡疏肝散)、健脾方(参苓白术散)和综合方(柴胡疏肝散和参苓白术散的合方)的高、低剂量进行干预,16周后各组大鼠腹主动脉采血,全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及肝组织TC、TG的含量;ELISA检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素1(IL-1)的水平;HE染色观察肝组织病理变化;实时荧光定量RT-PCR检测肝组织IKKβmRNA的表达水平;Western blotting检测肝组织IKKβ蛋白磷酸化水平的变化。结果:肝组织病理染色提示大鼠NASH造模成功,与正常组比较,模型组大鼠血清TC、LDL-C、肝组织TC、TG及炎症细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平均显著升高(P<0.01,P<0.05),肝组织IKKβmRNA及其磷酸化蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,肝组织TC、TG含量及血清TNF-α的含量以综合方高、低剂量组、健脾方高剂量组及疏肝方高剂量组下降显著(P<0.01,P<0.05);IL-1和IL-6含量均以综合方高剂量组降低显著(P<0.05),IKKβmRNA的表达水平以综合方高组及健脾方高组下调明显(P<0.05),磷酸化IKKβ蛋白的表达水平以健脾方高剂量组及综合方高、低剂量组下降最为显著(P<0.01,P<0.05)。结论:血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1和IL-6水平的显著升高、肝组织IKKβmRNA及其磷酸化蛋白的高表达可能参与NASH的发病。降低相关炎症细胞因子的含量、抑制IKKβmRNA及蛋白磷酸化可能是疏肝健脾方抗NASH的重要机制之一。

疏肝健脾方药对NASH大鼠Kupffer细胞NF-κB p65和IKKβ mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠Kupffer细胞核因子κB(NF-κB)p65和IκB激酶β(IKKβ)mRNA及蛋白表达的影响。方法:采用高脂饲料喂养复制大鼠NASH模型,在施以造模因素的同时分别灌服疏肝方(柴胡疏肝散)、健脾方(参苓白术散)和综合方(柴胡疏肝散和参苓白术散的合方)的高、低剂量进行干预,16周后分离Kupffer细胞,Typan blue染色和流式细胞术(FCM)分别对Kupffer细胞进行活性和纯度鉴定;实时定量PCR法检测Kupffer细胞IKKβ和NF-κB p65 mRNA的表达水平;Western blotting法检测Kupffer细胞IKKβ、p-IKKβ和NF-κB p65蛋白水平。结果:每只大鼠获得纯化的Kupffer细胞(1.5～2.0)×107,Typan blue染色显示这些细胞活力均在95%以上,FCM检测纯度均在90%以上;与正常组比较,模型组Kupffer细胞IKKβmR-NA及蛋白的表达水平均明显升高(P<0 01);与模型组比较,高剂量综合方、健脾方和疏肝方组IKKβmRNA的表达水平下调明显(P<0.01或P<0.05);IKKβ及磷酸化蛋白的表达水平以高剂量健脾方组下降最为显著(P<0.01或P<0.05);与正常组比较,模型组Kupffer细胞NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01),与模型组比较,NF-κB p65 mRNA的表达水平以综合方组及高剂量健脾方组下调明显(P<0.05),NF-κBp65蛋白的表达水平以高剂量健脾方组下降最为显著(P<0.01)。结论:Kupffer细胞IKKβ、NF-κB p65 mRNA及IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白的高表达可能参与NASH的发病,抑制这些信号分子的表达可能是疏肝健脾方药抗NASH的重要机制之一。

RIP2对大肠杆菌的抗菌作用研究

目的:探讨受体相互作用蛋白2(RIP2)对人肠细胞清除大肠杆菌的作用。方法:使用阳离子聚合物JetPeiTM介导人RIP2基因(pEGFP-C2-PIP2)转染人结肠癌SW480细胞株,以转染空质粒及未转染的SW480细胞株作为对照,应用RT-PCR检测外源性RIP2 mRNA水平的变化、Western blotting法检测细胞RIP2蛋白的表达;并利用大肠杆菌ATCC25922感染转染和未转染的SW480细胞24 h,用平板培养菌落计数活菌数。应用p38MAPK通路抑制剂SB203580作用于3组细胞,计数活菌数。结果:与对照组相比,转染RIP2组其mRNA和蛋白表达水平均有明显升高(P<0.01,P<0.05),表明RIP2表达质粒成功转染SW480细胞。转染RIP2细胞能清除胞内大肠杆菌;而阻断p38 MAPK信号通路后,RIP2清除胞内大肠杆菌的作用被阻断。结论:RIP2转染细胞可有效清除胞内大肠杆菌,这种胞内细菌的清除作用可能与p38 MAPK信号通路有关。这些结果提示RIP2在细菌感染性疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。

脂多糖性肺损伤小鼠肺组织结构改变及中药复方四毒清的干预效果

目的:探讨中药复方四毒清对脂多糖攻击小鼠肺组织结构及细胞间黏附分子1mRNA表达的影响。方法:实验于2003-10/2004-01在暨南大学医学院国家中医药三级科研实验室完成,选择健康雄性昆明小鼠60只,体质量21～26g。取40只小鼠,随机分成4组,每组10只。①对照组:用蒸馏水(20mL/kg)灌胃3d,2次/d。第3d灌胃后2h,腹腔注射20mL/kg生理盐水。②脂多糖组:除腹腔注射生理盐水改为注射脂多糖(30mg/kg,20mL/kg)外,其余处理同对照组。③四毒清防治组,用四毒清方药(由黄连、黄芩、赤芍、白薇、枳实、柴胡、三七组成,1g生药/mL,20mL/kg)灌胃3d,2次/d。第3d灌胃后2h,腹腔注射脂多糖(30mg/kg,20mL/kg)。④四毒清组,除腹腔注射改为生理盐水外,其余处理同四毒清防治组。于腹腔注射脂多糖或生理盐水12,36h后,各组分别处死5只小鼠,取肺组织切片,苏木精-伊红染色后在光学显微镜下观察其组织结构变化。另20只小鼠分批实验,分组及给药同上,每组5只,在腹腔注射脂多糖或生理盐水5h后,处死小鼠,提取肺组织RNA。应用反转录聚合酶链反应,以细胞间黏附分子条带的积分吸光度值与甘油醛-3-磷酸脱氢酶条带的积分吸光度值之比代表细胞间黏附分子1mRNA的表达量。结果:60只小鼠全部进入结果分析。①各组小鼠肺组织结构变化情况:脂多糖攻击12h后,脂多糖组出现急性肺损伤,组织学检查表现为肺水肿、出血和炎症细胞浸润。脂多糖组肺出血发生率高于四毒清防治组[80%,0,(χ2=3.352,P<0.05)]。脂多糖注射后36h,脂多糖组有2只小鼠存活,肺泡充满大量炎症细胞,出现肺实变。四毒清方药防治组,有3只小鼠存活,未见明显的肺实变。②各组小鼠肺组织细胞间黏附分子1mRNA的表达情况:脂多糖组明显高于对照组[1.21±0.26,0.68±0.03,(F=19.951,P<0.05)],四毒清防治组(0.78±0.03)明显低于脂多糖组(F=14.72,P<0.05)。结论:脂多糖攻击后,小鼠出现肺损伤及肺组织细胞间黏附分子1mRNA表达增加。中药复方四毒清能防治脂多糖性肺损伤,可能与其抑制脂多糖诱导的细胞间黏附分子1mRNA的表达有关。

α7烟碱受体拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的PC12细胞保护作用的研究

目的观察α7烟碱受体拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的PC12细胞远期影响,探讨其细胞保护的作用。方法采用高分化的PC12细胞为研究对象,以Aβ25-35制作细胞损伤模型,以烟碱受体激动剂(尼古丁)和α7烟碱受体拮抗剂(甲基牛扁亭碱)进行预处理。试验分为4组,分别是:对照组(蒸馏水)、模型组(Aβ25-35)、尼古丁组(尼古丁和Aβ25-35)、甲基牛扁亭碱组(甲基牛扁亭碱和Aβ25-35)。通过MTT比色法在多个时间点观察药物对细胞活力影响的动态变化,在此基础上采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡和坏死的影响。结果在所有时间点,模型组的细胞活力均显著低于对照组,凋亡和坏死率均高于对照组(P<0.01)。药物作用36～60h,尼古丁组的细胞活力显著高于模型组和甲基牛扁亭碱组(P<0.05),凋亡和坏死率较低(P<0.01);甲基牛扁亭碱组细胞活力及凋亡和坏死率与模型组差异无统计学意义。在药物作用84h后,与模型组和尼古丁组相比,甲基牛扁亭碱组细胞活力显著升高,凋亡和坏死率显著降低(P<0.01)。结论随着作用时间的延长(84h),烟碱受体激动剂(尼古丁)对PC12细胞的保护作用逐渐消失,而α7烟碱拮抗剂(甲基牛扁亭碱)逐渐显现出细胞保护作用。

扶正抗癌方治疗大鼠移植性肝癌的研究

目的:复制类似人类原发性肝癌发生发展的大鼠移植性肝癌模型,探讨"扶正抗癌方"对大鼠移植性肝癌的治疗作用及机制。方法:采用Walker256癌肉瘤细胞株接种SD大鼠复制原位种植肝癌模型,分为正常组、假手术组、模型组、抗癌扶正方低、中、高剂量组。定时记录体重、进食及饮水等生命体征;实验1周、2周、3周分别抽取动脉血,进行生化检测:包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、草/丙比值(S/L)、血清白蛋白(ALB)、白蛋白/球蛋白比值(A/G)及碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和岩藻糖苷酶(AFU);观察各组大鼠的生存时间。结果:实验3周时,扶正抗癌方高、中剂量组ALT、AST低于模型组(P<0.01),ALB及A/G比值高于模型组(P<0.05);高剂量组ALP、GGT、AFU活性明显低于模型组(P<0.01);高、中、低剂量组大鼠的生存率高于模型组(P<0.05)。结论:扶正抗癌方可改善移植性肝癌的大鼠生存状况;保护肝脏功能,降低肝ALT、AST释放;维持ALB水平;降低ALP、GGT、AFU的活性,最终延长移植性肝癌大鼠生存时间,其中以"扶正抗癌方"高剂量组疗效最好。

肾气丸对2型糖尿病阳虚证大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体及ATP酶活性的影响

目的:观察肾气丸对2型糖尿病阳虚证大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体及ATP酶活性的影响。方法:将60只SD大鼠随机分为正常组12只和造模组48只,造模组48只大鼠予以高糖高脂饲料喂养3周后,采用小剂量链脲佐菌素加氢化可的松注射造模,观察2周制备2型糖尿病(阳虚证)大鼠,随机分为模型组、肾气丸组、补阳组、罗格列酮组。给药3周后处死大鼠,采用酶联免疫分析(ELISA)法分别测定大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体及ATP酶的活性。结果:模型组Na^+-K^+-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性低于正常组(P<0.01);肾气丸组、罗格列酮组Na^+-K^+-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性明显高于模型组(P<0.05),但组间差异无统计学意义(P>0.05);补阳组Na^+-K^+-ATP酶、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性明显低于肾气丸组(P<0.01)。结论:肾气丸能改善2型糖尿病阳虚证大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP酶的活性。