单管双向等位基因专一性扩增的单核苷酸多态分型的新方法

目的 建立一种基于等位基因专一性 PCR原理的单核苷酸多态 (single nucleotidepolymorphism ,SNP)分型新方法 :单管双向等位基因专一性扩增 (single- tube bi- directional allele specificamplification,SB- ASA) ,并考察专一性引物的 3′端第 3位碱基不配对对特异延伸的影响。方法 一个PCR反应体系包含两个 3′末端分别与 SNP两个等位基因特异结合的引物 ,它们延伸方向相反 ,产生长度不同的等位基因专一性扩增产物 ,同时在两个等位基因特异性引物的 3′端第 3位碱基引入不配对以增加特异性。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后分析确定样本的基因型。观察在不同的温度条件下 ,近 3′末端引入与不引入碱基不配对时两种引物特异延伸的情况 ,比较两种引物能特异延伸的退火温度 (annealingtemperature,Ta)范围。结果 对于 4个不同类型的 SNP位点 ,SB- ASA都成功地分型了 36个样本 ,与直接测序的结果完全一致。两条专一性引物 3′端第 3位碱基引入不配对后 ,能特异延伸的退火温度 Ta范围分别从 6 4℃～ 6 9℃、6 0℃～ 6 2℃扩大到 46℃～ 6 6℃、5 6℃～ 6 1℃。结论 SB- ASA是一种简单快速而有效的 SNP分型新方法 ;在等位基因专一性 PCR体系中 ,专一性引物 3′端第