戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究

E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239（aa368～606）形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性，较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构。利用P239吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附，多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性。P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性。对阻断P239吸附的线性单抗进行定位，初步确定了P239与细胞相互作用的区域：ORF2上的aa423～443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近，或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索。

戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗H-2^d限制性Th表位的筛选

戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原HEV239能形成类病毒颗粒，具备演变成多价疫苗的载体的潜力，此文旨在筛选、鉴定其内包含的H-2^4限制性Th表位。以50μg HEV 239蛋白与完全弗式佐剂混合后皮下免疫BALB／c鼠，以覆盖HEV 239蛋白全长的15氨基酸肽库体外刺激其脾细胞，用IFN-γ-ELISPOT方法检测其细胞免疫应答，并通过磁珠剔除脾细胞中CD4^＋ T细胞或CD8^＋ T细胞以分析筛选得到的T细胞表位的特性。结果显示：HEV239中包含优势的T细胞表位P34（HEV PORF2 AA533～AA547，HSKTF FVLPL RGKLS）及数个较弱的T细胞表位。P34对HEV 239免疫的BALB／c鼠脾细胞的刺激效果与HEV 239蛋白相当，剔除实验表明该表位为CD4^＋T细胞表位，即Th表位。

戊肝病毒Th表位肽免疫可增强其载体蛋白的体液免疫应答

戊型肝炎病毒衣壳蛋白内包含一个强H-2d限制性Th表位P34。以该表位肽免疫BALB/c鼠,其脾细胞能够在体外识别重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白,剔除实验表明应答细胞几乎完全是CD4+T细胞,证明P34表位肽能有效诱导产生特异性Th细胞。以P34肽初免小鼠,再以包含该表位的重组戊型肝炎病毒抗原(E2)免疫,结果表明,10μg、20μgE2免疫组在免疫后第1周即有部分小鼠产生抗体,到第3周所有小鼠均能够产生抗体;而对照肽P18初免的小鼠,以20μgE2加强免疫亦无法诱导小鼠产生抗体。这表明,Th表位肽P34初免诱导产生的Th细胞能够有效促进小鼠对携带该表位的载体蛋白的体液免疫应答。

老年人胃癌肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态

目的分析老年人胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法,检测51例老年人胃癌及其癌旁小凹上皮和15例慢性胃炎小凹上皮石蜡标本中E钙黏素(E-CD)、错配修复酶hMLH1、APC和6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子区甲基化状态。结果在胃癌组织及其癌旁小凹上皮和慢性胃炎小凹上皮中,基因总的甲基化率分别为70.6%(36/51例)、47.0%(24/51例)和6.6%(1/15例),三者之间差别有统计学意义(P<0.01)。Lauren弥漫型、Ming浸润型、低分化和未分化、Ⅲ期和Ⅳ期、T3和T4以及有淋巴结转移胃癌的甲基化率分别高于Lauren肠型、Ming膨胀型、高和中分化、Ⅰ期和Ⅱ期、T1和T2以及无淋巴结转移胃癌的甲基化率(均P<0.05)。结论E-CD、hMLH1、APC和MGMT基因启动子区甲基化在慢性胃炎小凹上皮中少见,在癌旁小凹上皮中频繁出现,在胃癌组织中普遍存在,提示甲基化可能是胃癌发生的早期事件。

老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生-不典型增生-腺癌微卫星改变

目的评估老年人食管鳞状细胞癌(ESCC)、食管腺癌(EADC)和Barrett化生-不典型增生-腺癌序列DNA微卫星的改变。方法应用稀释性PCR技术检测老年人ESCC、EADC和Barrett化生-不典型增生-腺癌序列中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S617个位点DNA微卫星的改变。结果在非稀释DNA中,23例老年人ESCC和18例老年人EADC微卫星不稳定性(MSI)的频率分别是47.8%(11/23例)和38.9%(7/18例),杂合性丢失(LOH)的频率分别是26.1%(6/23例)和16.7%(3/18例),两者的MSI或LOH频率比较没有显著差别(P>0.05)。在稀释DNA中,8例老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生-异型增生-腺癌序列的MSI和LOH频繁出现,尤其在D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点上,与非稀释DNA的MSI和LOH频率相比有显著差别(P<0.05)。结论老年人ESCC和EADC微卫星改变没有差别。老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生-异型增生-腺癌组织DNA的MSI和LOH普遍存在,它们可能是EADC发生发展的早期分子事件,D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点的微卫星改变可能在此过程中起着重要作用。

胃癌组织中相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态

目的分析胃癌组织中肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态及其与临床分期、分型的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应方法,检测106例胃癌及其邻近胃小凹上皮、16例慢性胃炎小凹上皮石蜡标本中 E 钙黏素(E-CD)、错配修复酶 hMLHl、APC 和6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(MGMT)基因启动子区甲基化状态,并对其中46例胃癌采用免疫组化方法检测 E-CD 蛋白表达情况。结果在胃癌、胃癌邻近小凹上皮及慢性胃炎小凹上皮中,基因甲基化频率分别为72.6%(77/106)、44.3%(47/106)和12.5%(2/16),三者间差异有统计学意义(P<0.01)。Laurén 弥漫型胃癌甲基化(80.6%,50/62)明显高于肠型胃癌甲基化(61.4%,27/44),两者间差异有统计学意义(P<0.01)。甲基化与患者的年龄、性别、Ming 分型及区域淋巴结转移无关(均 P>0.05),甲基化与胃癌的浸润深度、pTNM 分期和分化程度有关(均 P<0.05)。行 E-CD 蛋白检测的46例胃痛中,22例有 E-CD 基因甲基化,其中20例(90.9%)E-CD 蛋白呈异质性减弱或基本消失表达;24例无 E-CD基因甲基化,其中9例(37.5%)E-CD 蛋白呈异质性减弱或基本消失表达,两者间差异有统计学意义(P<0.01)。结论上述肿瘤抑制基因启动了区甲基化可能是胃癌发生的早期事件。胃癌 E-CD 基因甲基化与 E-CD 蛋白异质性减弱或消失表达密切相关。

老年人食管鳞状上皮化生和不典型增生及腺癌序列微卫星改变

目的评估老年人食管鳞状上皮和化生-不典型增生-腺癌的微卫星变化。方法应用稀释性聚合酶链反应（PCR）方法检测存档手术切除的食管癌标本中的D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S61位点微卫星的变化。结果在非稀释DNA中，17例食管鳞状细胞癌和12例腺癌微卫星不稳定性（MSI）的频率分别是52．9％（9例）和41．7％（5例），杂合性丢失（LOH）的频率分别是23．5％（4例）和16．7％（2例），两者差异均无统计学意义（P〉0．05）。在8例食管鳞状上皮和化生-不典型增生-腺癌组织稀释DNA中，MSI和LOH频繁出现，与其非稀释DNA的结果比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论MSI和LOH在上述组织中普遍存在，它们可能是食管腺癌发生、发展的早期事件。