华南地区猪场环境中蔬菜细菌携带耐药基因情况调查

【目的】了解华南地区猪场环境中蔬菜样品附生细菌和内生细菌的耐药基因携带情况.【方法】采用PCR结合测序的方法检测氨基糖苷类、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类和林可霉素类耐药基因的携带情况.【结果和结论】四环素类耐药基因的分布范围比较广,附生细菌和内生细菌中此类耐药基因的场区检出率均为90%(9/10);蔬菜样品附生细菌和内生细菌所含的耐药基因是有差别的,而且附生细菌中的耐药基因比内生细菌的丰富,A、B、C、D、E、F、G、H、I和J样品附生细菌耐药基因的检出率分别是77.78%(21/27)、92.59%(25/27)、92.59%(25/27)、51.85%(14/27)、33.33%(9/27)、92.59%(25/27)、77.78%(21/27)、7.41%(2/27)、81.48%(22/27)和77.78%(21/27),内生细菌耐药基因的检出率分别是0(0/27)、11.11%(3/27)、11.11%(3/27)、11.11%(3/27)、29.63%(8/27)、48.15%(13/27)、29.63%(8/27)、33.33%(9/27)、25.93%(7/27)和22.22%(6/27).表明蔬菜中细菌的耐药情况,尤其是附生细菌的耐药情况可能已经非常严重,长此以往甚至会抑制作物生长,并且通过食物链危及动物和人体健康,应引起足够的重视.

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISPR-);CRISPR+金葡球菌携带耐药基因、毒力基因的数目显著小于CRISPR-金葡菌。实验室60株金葡菌中,有14株为CRISPR+,46株为CRISPR-;CRISPR+金葡菌携带更少的耐药基因和毒力基因,与公共数据库分析结果一致。对原噬菌体和接合质粒的分析结果显示,CRISPR-菌株携带更多的原噬菌体序列,与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05);接合质粒方面,CRISPR-和CRISPR+菌株无显著性差异。【结论】CRISPR结构可能限制了金葡菌中耐药基因和毒力基因的水平转移,CRISPR-菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究为进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播提供了参考。

氟苯尼考联合铜环境胁迫对土壤固氮菌成膜能力及相关基因表达的研究

[目的]研究氟苯尼考和铜(Cu)残留对土壤固氮菌的生态毒性效应,为评价兽药的环境风险提供依据。[方法]对从花生根际土壤中分离出的一株优势固氮菌RpEC2071进行氟苯尼考和铜胁迫处理,试验设置空白组(0μg/mL)、氟苯尼考添加组(40μg/mL)、Cu添加组(200μg/mL)和混合组(氟苯尼考40μg/mL+Cu 200μg/mL),并于给药后采样。采用苯酚硫酸法和96孔法研究氟苯尼考和Cu单独或联合处理对固氮菌胞外多糖产生及生物膜形成能力的影响。采用RT-qPCR测定分析固氮菌生物膜及固氮相关基因的mRNA表达水平。[结果]氟苯尼考和Cu单独胁迫会促进生物膜的形成,二者生物膜形成能力约为空白组的2倍;混合胁迫会抑制生物膜的形成,空白组生物膜形成能力是其3.1倍。胞外多糖分泌结果与生物膜形成能力测定结果基本一致。生物膜相关基因与氮代谢调控基因呈显著正相关,氟苯尼考和Cu的添加改变了fli Q、nif H和nnr R等基因的表达水平,且二者联合处理后会对其表达分别产生协同或拮抗作用。[结论]氟苯尼考与Cu的单独或联合胁迫影响固氮菌RpEC2071中生物膜相关基因表达,进而对其生物膜形成能力产生影响。预示了以氟苯尼考和Cu为例的兽药及重金属残留胁迫会对土壤固氮菌产生潜在的生态毒性效应,从而破坏土壤中固氮生态系统。

金霉素胁迫下室内粪土模型中菌群多样性与四环素类抗生素耐药基因丰度研究

【目的】探究金霉素在粪土环境中对土壤微生物群落结构多样性和四环素类耐药基因(TRG)丰度的影响。【方法】分别设置金霉素质量0(对照)、10、100、1 000μg作为胁迫剂量,在处理后第1、7、14、28、56天采集样品,使用高通量测序和q PCR技术研究群落结构多样性和TRG丰度的变化。【结果】厚壁菌门能耐受低剂量(10μg)金霉素的毒害作用,对中、高剂量(100、1 000μg)敏感;放线菌门能耐受中、高剂量的毒害作用,生存繁殖具有一定优势;变形菌门的相对丰度除第28天各剂量组均显著低于对照组外,其余时间多显著高于对照组。金霉素–猪粪–土壤模型样品中共检测出3种四环素类抗生素耐药基因(TRGs):tet O、tet T和tet W,3个基因丰度变化趋势相似:与第1天相比,第56天各组TRGs相对含量均显著减少;低剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅱ期高于对照组和中、高剂量组,第7天TRGs相对含量显著高于对照组以及中、高剂量组;中剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅳ期低于其余组,第56天TRGs相对含量显著高于其余组。【结论】在猪粪–土壤环境中,不同菌群对金霉素敏感程度不同,金霉素可改变优势菌群的相对丰度,从而引起菌群群落结构的变化。金霉素可改变TRGs相对含量的日消减率,从而影响TRGs相对含量。本研究可为下一步养殖源性抗菌药物残留的生态风险评估提供一定依据。

小番茄内生菌耐药基因检测及种植模型中GFP标记菌转移研究

【目的】调查广州市售小番茄内生菌中常用抗菌药物耐药基因流行情况及基于绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠埃希菌人工栽种模型探讨耐药基因转移进入小番茄果实内的可能性。【方法】采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法分离鉴定市售小番茄内生菌,PCR定性检测内生菌中氯霉素类(cmlA)、四环素类(tetA和tetM)、磺胺类(sul1、sul2和sul3)和喹诺酮类(oqxA、oqxB、qnrB、qnrS和qepA)等药物耐药基因的流行情况;采用GFP标记–大肠埃希菌人工种植模型检测小番茄果实、叶片和根系中目标GFP菌,探讨内生菌及GFP标记进入小番茄内部的可能性。【结果】市售小番茄分离的52株内生菌菌株中,肠杆菌属Enterobacter和克雷伯菌属Klebsiella占有较高比例,几乎所有菌株均携带oqx B基因(总阳性率达92.31%),在人工种植模型第27天采集的果实中分离出含有GFP标记的内生菌。【结论】小番茄内生菌中oqx B基因最为流行,耐药基因可通过根系浇灌的方式转移到小番茄果实内。

广东肇庆地区鸭疫里氏杆菌耐药性和毒力基因分析及ERIC-PCR分型研究

为了解广东省肇庆市鸭疫里氏杆菌的流行和耐药现状,本试验对当地4个养鸭场疑似传染性浆膜炎的病鸭进行细菌分离纯化、PCR鉴定,并对分离菌株进行了药敏试验、耐药基因、毒力基因检测及ERIC-PCR分型试验。药敏结果表明,14株鸭疫里氏杆菌对新霉素、安普霉素、恩诺沙星、替加环素、复方新诺明高度耐药,耐药率均为100%;对阿莫西林、头孢他啶和环丙沙星敏感度较高,敏感率分别为100%、100%和92.86%。耐药基因检测结果显示,所有分离菌均携带tet(X)和floR耐药基因,tet(B)和su l1耐药基因的检出率分别为64.29%和50%,其余9种耐药基因(aac(6′)-Ⅰb、aph(3')-Ⅱ、bla_(SHV)、bla_(DHA)、qnrA、qnr B、tet(A)、tet(C)、sul2)未被检出。毒力基因检测结果显示,AS87_04050、luxE和wza毒力基因的检出率较高,分别为100%、92.86%和100%,而TbdR 1均未被检出。ERIC-PCR分型试验结果表明,14株鸭疫里氏杆菌均成功分型,相似性在90%时,可分为7个基因型。本实验为广东省肇庆市鸭疫里氏杆菌病的治疗措施提供理论依据。

洛克沙胂暴露对土壤微生物碳代谢功能多样性的影响

【目的】运用Biolog法分析洛克沙胂作用下的土壤微生物群落碳代谢多样性，以揭示洛克沙胂在环境中残留对土壤微生物学性状的影响。【方法】采集新鲜土壤加入不同质量浓度的洛克沙胂溶液混匀，使药物质量分数（以As计）分别为：低质量分数组15 mg· kg-1、中质量分数组75 mg· kg-1、高质量分数组150 mg· kg-1，放置在室温（20～25℃）下培养，于处理后第1、2、3、5、8周分别采取培养土壤，用Biolog法进行分析。【结果和讨论】洛克沙胂对土壤微生物群落碳代谢功能影响显著，且存在一定的剂量依赖效应。经主成分分析，第1周，洛克沙胂低质量分数组（ w＝15 mg· kg -1）土壤微生物群落多样性和对照组差异不明显，第2、3、5、8周，各组土壤微生物群落碳代谢类型差异显著，其中高质量分数组（ w＝150 mg· kg-1）与对照组差异最大。结果表明，洛克沙胂可致土壤微生物群落碳代谢能力与多样性改变，胁迫浓度越高其作用越强。同时，洛克沙胂对土壤微生物群落碳代谢能力与多样性的影响还表现出时间差异，在暴露胁迫的后期（第5、8周），洛克沙胂的影响逐步减弱，可能与洛克沙胂在土壤中发生化学结构改变和降解有关。

鸡饲喂洛克沙胂后排泄物中As的形态分析及光降解研究

【目的】探讨洛克沙胂在鸡饲后的排泄规律及对环境生态的毒性．【方法】选用健康黄鸡饲喂含洛克沙胂50mg／kg的全价饲料，连续给药10d，给药期间及停药后收集不同时间点排泄物样，采用微波消解-原子荧光光度法测定鸡排泄物中总砷和无机As（V）、As（Ⅲ）质量分数，高效液相色谱法（HPLC）测定鸡排泄物中洛克沙胂的质量分数．将不同时问点收集的鸡排泄物进行洛克沙胂的光降解试验．【结果和结论】鸡排泄物中砷的排泄量在饲后第108小时质量分数达到稳态（其中洛克沙胂为31．62～35．87mg／kg，总砷为16．75～21．48mg／kg），停饲后总砷与洛克沙胂的排泄量呈较快速下降，第120小时时鸡排泄物中已检测不出洛克沙胂，总砷亦降至3．89mg／kg，此过程中As（Ⅲ）、As（V）含量变化较小，两者最高值分别为0．38和1．81mg／kg．光降解试验中光照组鸡排泄物中洛克沙胂的降解率为100％，而避光组降解率仅为75．16％，其中无机As（V）、As（Ⅲ）的质量分数均随时间而升高，并以As（V）为主，两者在光照下含量变化速度均比相应避光组快．鸡饲喂洛克沙胂后主要以原形形式排泄，无论在避光或光照条件下鸡排泄物中洛克沙胂均可被降解生成无机砷形态，光照可加速鸡排泄物中洛克沙胂的降解．

洛克沙胂暴露胁迫对土壤微生物群落结构特征的影响

采用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)方法,分析了洛克沙胂残留对土壤微生物群落结构的影响特征。结果表明,在整个采样周期中,每克土壤总PLFA含量在洛克沙胂胁迫影响下出现明显降低,且存在一定的剂量依赖效应。经主成分分析,第1周,洛克沙胂低浓度组(w=15 mg·kg-1)土壤微生物群落结构和对照组差异不明显,第2、3、5、8周,各组土壤微生物群落结构多样性的类型差异显著,其中高浓度组(w=150 mg·kg-1)与对照组差异最大。结果表明,洛克沙胂可致土壤微生物群落结构多样性改变,暴露浓度越高其作用越强。同时,洛克沙胂对土壤微生物群落结构多样性的影响还表现出时间差异,在暴露胁迫的后期(第5、8周),洛克沙胂的影响逐步减弱,可能与洛克沙胂在土壤中发生化学结构改变和降解有关。

广州市流溪河沉积物反硝化细菌群落丰度与结构多样性研究

【目的】研究广州市流溪河沉积物中反硝化细菌的多样性,探讨环境因子对反硝化细菌群落结构和丰度的影响。【方法】通过构建基因文库和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对沉积物中反硝化细菌的群落结构和丰度进行分析,并结合主坐标分析(PCoA)和冗余分析(RDA)研究反硝化细菌群落与环境因子之间的相关性。【结果】流溪河流域不同采样位点沉积物中nirS型反硝化细菌的组成和丰度存在明显差异。沉积物中大多数nir S序列与已知的反硝化细菌亲缘关系较远,而与其他环境样品中的微生物亲缘关系较近,与流溪河沉积物中nirS反硝化细菌亲缘关系较近的物种有产黄杆菌属Rhodanobacter、副球菌属Paracoccus、Polymorphum gilvum、草螺菌属Herbaspirillum和陶厄氏菌属Thauera。氨氮(NH_4^+–N)和硝酸盐(NO_3~––N)含量对反硝化细菌群落结构起决定性作用。反硝化细菌nirS基因拷贝数范围为8.26×10~1~5.45×10~4 g^(-1),nirS型反硝化细菌数量与化学需氧量(COD)、总氮(TN)、NH_4^+–N、和NO_3~––N含量之间存在显著相关性。【结论】流溪河中化学污染物以及活性氮的大量存在显著影响了反硝化细菌群落结构和多样性。

外源磺胺二甲嘧啶对施用粪肥的菜地土壤中微生物群落多样性的影响

【目的】明确磺胺二甲嘧啶(SM2)随粪便施入土壤对土壤微生物群落造成的影响,为合理进行养殖场周围土壤环境质量评估和施肥管理提供参考依据。【方法】收集养殖场附近未经抗生素污染的粪便和土壤,构建粪便–土壤模型,设置不同SM2添加剂量的处理,分别为对照组(0)、低剂量组(5μg·kg^(-1))、中剂量组(500μg·kg^(-1))和高剂量组(5 000μg·kg^(-1)),并分别于粪便和SM2施入1、7、14和50 d后采集土壤样品,采用Biolog技术以及磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)标记法对比分析不同处理组土壤微生物群落的碳源利用能力、菌群结构和功能多样性变化。【结果】SM2的施入提高了土壤微生物群落的总体碳源利用能力,中、高剂量组在施入50 d时对除酯类以外的其他碳源利用能力均强于对照组。低剂量组在施入7 d内对各类碳源利用能力增强,中、高剂量SM2的施入可能会影响土壤群落某些优势物种的繁殖和数量分配。随施入时间的延长,土壤微生物群落对不同剂量SM2反应不同,革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌数量变化显著,放线菌变化不明显。【结论】SM2的施入将长期影响土壤微生物群落的结构与功能多样性。养殖场应及时处理动物排泄物以消除抗生素残留,减少粪肥对土壤环境造成的生态破坏。

室内粪土模型中土霉素对主要反硝化基因转录水平和菌群结构特征的影响

反硝化作用在土壤氮素循环中扮演着重要角色,而国内研究抗生素残留对反硝化作用的报道仍然较少。本实验通过构建室内抗生素-粪便-土壤模型,以研究空白组(0μg·kg^(-1))、低浓度组(20μg·kg^(-1))、中浓度组(200μg·kg^(-1))和高浓度组(2000μg·kg^(-1))土霉素对施加鸡粪后土壤中反硝化作用的影响。利用荧光定量PCR(qPCR)和限制性末端片段长度多态性(TRFLP)方法分析反硝化基因(nirS、nirK、narG和nosZ)的响应特征及反硝化菌群结构特点。qPCR定量结果表明低、中浓度土霉素对携带nirS、nirK基因的菌群有促进作用,而高浓度组则表现为抑制作用,而携带nosZ基因的菌群对土霉素的胁迫反应较迟钝。T-RFLP结果显示不同浓度土霉素并没有改变携带nirS基因和nosZ基因的优势菌群结构,而随着暴露时间的延长,携带nirS基因的反硝化优势片段在第30～60天之间发生了变化。这些结果表明不同浓度土霉素可以影响反硝化菌群丰度,但是却无法影响优势菌群,而土壤中其他因素可能对优势菌群的影响更大。

广东地区鸭-鱼混养场鸭粪中耐药基因的污染现状

采用荧光定量的方法对广东地区典型的鸭-鱼混养场中鸭粪中磺胺类、四环素类、β-内酰胺类和酰胺醇类的耐药基因丰度进行调查。结果显示:耐药基因的平均相对丰度为∑bla>∑tet>∑sul>∑cml;这17个耐药基因在所有的样品中均被检测到,其中sul1、sul2、tetO、tetA、tetB、blaTEM和fexB的平均相对丰度高分别达到了2.1×10-1copies/16SrDNA copies、3.82×10-1copies/16SrDNA copies、3.30×10-1 copies/16SrDNA copies、1.77×10-1 copies/16SrDNA copies、1.31×10-1 copies/16SrDNA copies、7.81×10-1 copies/16SrDNA copies和1.57×10-1 copies/16SrDNA copies,其中blaTEM的相对丰度最高。结果表明:鸭粪便中耐药基因的污染严重,其中β-内酰胺类药物耐药基因的丰度最高,酰胺醇类药物最低;在广东地区鸭粪中具有代表性的主要耐药基因,磺胺类是sul1和sul2;四环素类是tetO、tetA和tetB;β-内酰胺类是blaTEM;酰胺醇类是fexB、cmlA、fexA和floR。

鸡饲喂阿散酸后的排泄规律及其光降解试验

选用20日龄健康黄鸡30只,随机分为2组,每组15只,分别饲喂含0和200mg/kg阿散酸的全价饲料,试验时间为10d,混饲后收集不同时间的粪样,以微波消解-原子荧光测定法测定鸡粪中总砷的质量浓度,以高效液相色谱法测定鸡粪中阿散酸的质量浓度,了解阿散酸在鸡体内的排泄情况;将不同时间点收集的鸡粪进行阿散酸的光降解试验。结果,阿散酸在鸡粪中的排泄量在饲后第72小时达到稳态(阿散酸为63.42mg/kg,总砷为45.89mg/kg),阿散酸排泄量占总砷量的52.82%～58.96%。停饲后总砷、阿散酸排泄量呈较快速下降,第96小时鸡粪中已检不出阿散酸。光照组鸡粪中阿散酸的降解率为95.21%,避光组鸡粪中阿散酸的降解率为75.15%。结果表明,鸡饲喂阿散酸后主要以阿散酸原形的形式排泄;光照可以加速鸡粪中阿散酸的降解与转化。