常压室温等离子体-紫外复合诱变选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的通过对新硫肽类抗生素166A产生菌小单孢菌TMD166进行诱变选育研究,以期获得产166A的高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株TMD166的孢子进行等离子体-紫外(MPMS-UV)复合诱变,单孢子悬液经照射处理、涂布培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法对菌株进行初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用突变株摇瓶发酵的化学效价筛选出正突变菌株。结果对比MPMS-UV不同诱变剂量发现,MPMS105s-UV60s复合诱变剂量获得的正突变率最高,达到41.43%,相应致死率为99.88%。最终筛选出一株166A高产突变株TMD166-MU1,在培养温度为28℃、210 r/min的条件下,经过96~120 h培养后,166A产量相比出发菌株提高了7.47倍。结论采用MPMS-UV复合诱变方式,再结合牛津杯固体发酵高通量筛选方法和摇瓶复筛,可高效筛选获得166A高产菌株。

创新霉素生物合成研究进展

创新霉素是中国科学家20世纪60年代发现的具有全新骨架结构的抗生素,由济南游动放线菌产生,具有良好的抗菌活性和新颖的作用靶点,但创新霉素的生物合成基因簇在其发现50多年后才得到解析。本文介绍了创新霉素研究的历史沿革,着重介绍了其生物合成机制的最新研究进展,从生物合成基因簇、生物合成途径、新颖的去泛素化酶样的硫转移酶催化的硫掺入机制、罕见的细胞色素P450酶催化的C-S键形成机制等角度进行阐述,这些研究进展为利用组合生物合成和合成生物学技术进行新药研发和高产优产奠定了理论基础。

西伯利亚Gudzhirganskoe盐湖土壤放线菌多样性、新颖性及抗菌活性研究

目的探究西伯利亚Gudzhirganskoe盐湖土壤放线菌多样性、新颖性和活性菌株的次级代谢产物,为放线菌新物种和新抗生素的发现储备菌种资源。方法采用10种分离培养基,利用稀释涂布法进行放线菌的分离纯化;通过PCR扩增和测序,比对16S rRNA序列进行放线菌多样性和新颖性分析;采用纸片扩散法对潜在放线菌新物种发酵液的酯相萃取物、水相和菌体相进行抗菌活性筛选;采用反相柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和半制备HPLC方法分离纯化菌株Hoyosella sp.S15b3-3粗提物的活性成分,通过ESI-MS、NMR波谱数据,并结合文献确定化合物的结构;采用微量稀释法评价化合物1和2的抗菌活性。结果从15份样品中分离获得1343株放线菌,分属于10目23科42属,其中涅斯捷连科菌属、拟诺卡菌属和链霉菌属为优势菌属;15株放线菌与近缘菌株的16S rRNA基因的最高相似度≤98.65%;5株潜在新物种对至少1株检定菌表现出抗菌活性;从Hoyosella sp.S15b3-3中分离鉴定2个已知化合物1(3-吲哚甲醛)和2(2-羟基-1-(3-吲哚)乙酮),化合物1对2株鲍曼不动杆菌(2799和ATCC19606)有一定的抑制作用,MIC值分别为64和32μg/mL。结论西伯利亚Gudzhirganskoe盐湖土壤含有丰富的放线菌资源,且新颖性较高,具有从中发现放线菌新物种和新抗生素的潜力,值得深入研究。

以人载脂蛋白B为靶点的基因表达下调剂筛选模型的建立与应用

目的构建以人ApoB为靶点的基因表达调节剂的高通量筛选模型,筛选apoB基因表达下调剂。方法以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增apoB基因上游的启动子序列,将扩增的DNA片段克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞株。应用槲皮素对筛选模型进行评价,进而基于检测荧光素酶的表达活性变化筛选人apoB基因表达下调剂。结果PCR扩增得到人apoB基因上游的启动子序列,构建完成相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-apoB-P,建立了稳定转染细胞株ApoB-Luc HepG2。以槲皮素为阳性化合物进行模型评价,Z'因子为0.77,符合高通量筛选的要求。应用该模型对5688个微生物发酵液粗提物进行筛选,获得了2株阳性菌株。结论建立了人apoB基因表达下调剂筛选模型,并应用于微生物来源样品的筛选。

复合诱变选育抗菌肽Sublancin高产菌株

Bacillus subtilis BF168可以产生一种新型的抗菌肽Sublancin,Sublancin具有明显的抗革兰氏阳性菌活性,但产量较低。为了获得Sublancin高产菌株,对其产生菌B. subtilis BF168进行诱变选育研究。以B. subtilis BF168为出发菌株,采用加热、紫外(Ultraviolet,UV)、氯化锂(Li Cl)、微波(Microwave,MW)和UV-Li Cl、UV-MW、MW-LiCl处理技术分别进行单一诱变和复合诱变,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在培养基平板上培养后获得单菌落,通过菌株致死率和正突变率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果表明:单一诱变最佳参数分别是热诱变为80℃处理10 min;UV诱变为功率30 W、照射距离30 cm、照射时间90 s;Li Cl诱变浓度为12 g/L;MW诱变为脉冲频率2 450 MHz、功率800 W、辐射时间100 s。在不同诱变方法对比中发现,UV-Li Cl复合诱变方式可获得最高的正突变率,以突变株的发酵效价为指标的正突变率和致死率分别为21.05%和92.18%,复筛效价是出发菌株1.6倍以上的有4株,占复筛菌株的10%。经过多种方法复合诱变,最终获得一株遗传性状稳定的Sublancin高产菌株UL2,在培养温度为37℃、210 r/min的条件下,经过28~30 h培养后,该菌株的相对效价达到(204±2.83)%。实验证实UV-LiCl复合诱变可以显著提高BF168菌株的Sublancin发酵产量。

基于胰腺癌细胞的杂化外泌体的不同制备方法与表征的比较研究

本研究基于外泌体的高亲和力、良好稳定性和低免疫原性,以及脂质体的长循环和被动靶向性的特点,结合外泌体和脂质体的各自优势,利用人胰腺癌细胞分泌的外泌体,通过与脂质体膜融合后自组装,成功构建一种新型纳米载药系统即杂化外泌体,并在实验室条件下,进行孵育和冻融法两种制备方法的比较和表征。结果表明,分别利用人胰腺癌HuP-T3和Panc0403细胞系连续培养48 h后提取的外泌体产量最高,利用前者的外泌体产量为0.83±0.07 mg/10^(8)细胞,后者为0.79±0.10 mg/10^(8)细胞;并且,与经12 h、37℃孵育法相比,经冻融法获得的杂化外泌体的膜融合度高,粒径和多分散指数(PDI)值较低, zeta电位绝对值大,提示该方法制备的杂化外泌体稳定性更好。研究表明,冻融法得到的杂化外泌体具有更简便的制备方法和适宜的理化性质,这为后续包载不同抗癌药物以构建载药递送系统治疗胰腺癌等实体瘤提供了较为扎实的前期实验基础。