miR-488-3p靶向调控RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬的作用研究

目的探讨微小RNA(miR-488-3p)通过靶向调控RAS癌基因家族成员RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬中的作用。方法体外常规培养人正常肝细胞(HL-7702),并给予100μmol/L Hcy干预24 h,采用Western blot检测肝细胞自噬相关蛋白LC3、p62和RAP1A的表达水平,qRT-PCR检测肝细胞中miR-488-3p和RAP1A的表达;转染miR-488-3p inhibitor和mimics后,qRT-PCR和Western blot分别检测miR-488-3p的转染效率及其对LC3和p62蛋白表达的影响;TargetScan预测miR-488-3p与RAP1A基因相关性,Western blot检测miR-488-3p下游潜在靶蛋白(RAP1A)的表达改变;Pearson相关系数对肝细胞中miR-488-3p表达水平与自噬相关蛋白水平进行相关性分析。结果与Control组相比,Hcy组肝细胞自噬相关蛋白LC3、RAP1A和miR-488-3p的表达水平升高(P<0.01),而p62表达明显降低(P<0.01);同时,转染miR-488-3p inhibitor和mimics后,与NC-inhibitor组比较,miR-488-3p inhibitor组中LC3和RAP1A蛋白的表达水平显著降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.01);而与NC-mimics组相比,miR-488-3p mimics组中LC3和RAP1A蛋白表达水平明显增加(P<0.01),p62表达降低(P<0.01);进一步机制研究表明RAP1A是miR-488-3p的下游靶基因并受其正向调控。Pearson相关性分析发现,miR-488-3p的表达水平与LC3(r=0.9329,P=0.0002)蛋白表达呈正相关,而与p62(r=-0.8086,P=0.0083)表达则呈负相关。结论miR-488-3p在Hcy介导的肝细胞中高表达,可通过靶向调控RAP1A的表达促进肝细胞自噬。

脂肪酸结合蛋白4对高同型半胱氨酸血症小鼠足细胞凋亡的影响

目的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)可能对足细胞凋亡有调控作用,但具体机制目前报道较少。文章旨在探讨FABP4在高同型半胱氨酸血症(HHcy)引起小鼠足细胞凋亡中的作用。方法实验采用9只野生型雄性C57BL/6J小鼠(Cbs^+/+)为对照组;9只以C57BL/6J背景的胱硫醚β合酶基因敲除杂合子(Cbs^+/-)雄性小鼠为模型组。两组同时给予含2%高蛋氨酸饲料,连续饲养8周,以复制HHcy模型,采用透射电镜观察两组小鼠肾小球足细胞超微结构。同时,体外培养肾小球足细胞,未干预组采用0μmol/L Hcy处理48 h,同型半胱氨酸组采用80μmol/L Hcy处理48 h,Ad-GFP组足细胞感染GFP荧光标签腺病毒,Ad-FABP4组足细胞感染FABP4腺病毒,Hcy+Ad-FABP4组足细胞感染FABP4腺病毒后处理同同型半胱氨酸组。通过qRT-PCR、Western blot检测FABP4在小鼠肾组织中的表达,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-12的变化,流式细胞仪技术分析细胞凋亡率。结果与对照组比较,模型组小鼠肾组织足细胞损伤程度加重、并发生细胞凋亡。同时,模型组中FABP4的mRNA表达量(3.20±0.42)和蛋白表达量(4.98±1.12)均较对照组(2.09±0.13、3.04±0.11)升高(P<0.05);同型半胱氨酸组中FABP4的mRNA表达量(5.34±0.28)和蛋白表达量(11.94±0.22)均较未干预组(4.00±0.17、5.10±0.20)升高(P<0.05)。感染FABP4腺病毒后,Ad-FABP4组FABP4的mRNA表达量(4.59±0.28)和蛋白表达量(10.07±0.82)均较Ad-GFP组(3.05±0.22、4.07±0.20)升高(P<0.05)。同型半胱氨酸组Bax/Bcl-2值(3.15±0.65)和Caspase-12蛋白表达量(4.30±0.89)较未干预组(2.19±0.10、3.06±0.07)升高(P<0.05);Hcy+Ad-FABP4组Bax/Bcl-2值(5.42±0.55)和Caspase-12蛋白表达量(7.87±1.27)均较Hcy+Ad-GFP组(3.19±0.47、4.34±0.64)升高(P<0.05)。流式细胞仪分析凋亡结果显示,同型半胱氨酸组总凋亡率为(10.85±1.25)与未干预组(3.77±0.12)比较升高(P<0.05);Hcy+Ad-FABP4组(15.72±1.60)较Hcy+Ad-GFP组(11.22±0.43)升高(P<0.05)。结论FABP4在HHcy引起的小鼠足细胞凋亡过程中起促进作用。

miR-133b在紫檀芪抑制肾脏纤维化的作用研究

目的探讨miR-133b在紫檀芪(pterostilbene)抑制肾脏纤维化过程中的作用。方法选取ICR小鼠18只,随机分为对照组(皮下注射生理盐水7 mg/kg)、模型组(皮下注射异丙基肾上腺7 mg/kg)与治疗组(模型组基础上腹腔注射紫檀芪10 mg/kg),每组6只。采用HE染色和Masson染色观察小鼠肾脏的病理变化;通过生物信息学分析验证miRNA-133b与下游COL8A2(胶原蛋白VIII型α2链)、COL5A1(胶原蛋白V型α1链)的靶向调控关系;采用荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检验miRNA-133b以及胶原蛋白8A2(COL8A2)、胶原蛋白5A1(COL5A1)的mRNA相对表达水平。结果相比对照组,模型组miR-133b表达显著降低(P<0.01);治疗组miR-133b表达明显高于模型组(P<0.05)。通过生物信息学分析发现miR-133b与COL8A2和COL5A1存在潜在靶向结合关系。RT-qPCR显示,相比对照组,模型组COL8A2和COL5A1的m RNA表达水平均明显升高(P<0.01);相较于模型组,治疗组的mRNA水平明显降低(P<0.01)。且COL8A2、COL5A1与miR-133b之间具有显著负相关性(R2=0.689 4、0.780 8,P<0.01)。结论紫檀芪具有改善肾脏纤维化的作用,其机制可能与上调miR-133b表达有关。

G9a在L-NAME诱导胎盘滋养细胞自噬中的作用

目的探讨组蛋白甲基转移酶G9a在胎盘滋养细胞自噬中的作用。方法体外培养人胎盘滋养细胞,加入100μmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)干预48 h后,Western blot检测自噬相关蛋白LC3II/I,p62以及G9a的蛋白表达,感染自噬流双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3双标腺病毒)观察自噬流的改变,了解L-NAME对滋养细胞自噬的影响及G9a的表达改变;在细胞中转染G9a过表达腺病毒及干扰质粒,Western blot和qRT-PCR对G9a自身表达进行验证,同时给予100μmol/L L-NAME后,Western blot检测自噬相关蛋白LC3II/I和p62的蛋白表达,阐明G9a在L-NAME介导的滋养细胞自噬中的作用。结果与对照组比较,L-NAME组LC3II/I增加1.4倍,p62表达降低40%,G9a表达降低38%,差异均有统计学意义(P<0.05);且观察到滋养细胞内自噬体及自噬溶酶体均增多,自噬增强。过表达G9a后自噬相关蛋白LC3II/I表达降低降22%,p62表达升高2.12倍,差异有统计学意义(P<0.05);干扰G9a后,p62表达降低62%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论G9a可抑制L-NAME诱导的胎盘滋养细胞自噬的发生。