寄生虫病原实验室生物安全风险评估规范化培训方案建立及探讨

随着《中华人民共和国生物安全法》的颁布实施,病原微生物实验室的生物安全管理被提到了前所未有的高度。开展规范化的生物安全培训,可以有效提高实验室人员的生物安全意识和安全技能,防止实验室发生生物安全事故。因此,为了解寄生虫病原实验室的生物安全培训需求和重点,笔者在问卷调查、访谈等工作基础上,明确了寄生虫病原实验室开展生物安全风险评估培训的必要性,初步建立了寄生虫病原实验室生物安全风险评估规范化培训方案,确立了培训目的、培训对象、培训内容、培训方式及培训评估方法,以期为各地寄生虫病原实验室开展生物安全风险评估规范化培训提供参考。

2021年全国寄生虫病健康教育作品评比结果分析

目的分析2021年全国寄生虫病健康教育作品评比结果,为我国寄生虫病健康教育工作提供参考。方法对中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所面向全国征集的寄生虫病健康教育作品,从科学性、创意性、可接受性、可推广性4个维度综合评选出优秀作品;并从创作形式、目标病种、目标人群和应用语种等方面对所有参评作品进行统计分析。结果共26个省份提交了178件健康教育作品,其中实物作品70件(占39.33%),平面作品59件(占33.15%),影音作品49件(占27.53%)。所有作品中,由单一机构创作的有173件,其中疾病预防控制机构(含专业寄生虫病防治机构)创作的作品为170件(占98.27%);作品目标人群以普通群众为主(77.53%,138/178);目标病种以单一寄生虫病为主(87.08%,155/178),其中疟疾(40.00%,62/155)、血吸虫病(23.23%,36/155)、棘球蚴病(18.06%,28/155)作品类数量位居前三;以单一汉语作为应用语种的作品最多(90.45%,161/178)。获奖作品共30件,其中实物作品、平面作品、影音作品各10件;主要针对单一病种(83.33%,25/30),其中棘球蚴病(32.00%,8/25)、血吸虫病(24.00%,6/25)、疟疾(16.00%,4/25)作品数位居前三;应用语种为单一汉语的作品数最多(83.33%,25/30);获奖作品涉及14个省份,其中获奖数最多的省份为四川(6件)。结论本次参评的寄生虫病健康教育作品来源广泛、形式多样、目标病种涵盖面广。部分作品在形式上有所创新,融入了民族习俗,有利于覆盖少数民族群体。今后应鼓励基层参与健康教育作品开发,加强机构间合作,开展人群需求分析,进一步提升健康教育作品的针对性。

新孢子虫硫氧还蛋白的生物信息学分析及其原核表达的鉴定

为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并对其蛋白互作网络中排名前100的蛋白进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析。重组质粒中NcTrx基因的测序结果显示,NcTrx基因片段为1 287 bp,编码428个氨基酸;该蛋白含1个信号肽,1个跨膜区,主要位于内质网上;NcTrx蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成,有12个B细胞抗原表位;该蛋白属于硫氧还蛋白家族,存在典型的氧化还原基序“-CXXC-”,有38个磷酸化位点、10个O-糖基化位点;与NcTrx蛋白互作最强的为酪氨酸激酶样蛋白,二者通过氢键和静电作用实现相互对接;GO功能及KEGG信号通路的显著性富集分析结果显示,NcTrx与其互作的蛋白主要参与蛋白质转运、蛋白质二硫键异构酶活性等生物学过程,与内质网蛋白质加工、硫代谢等信号通路密切相关。将pET-32a(+)-NcTrx转化BL21(DE3)感受态细胞,并经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法纯化重组NcTrx蛋白(rNcTrx),经SDS-PAGE检测该蛋白的表达及纯化效果,采用Bradford法测定纯化蛋白的浓度。采用western blot鉴定rNcTrx的反应原性。SDS-PAGE结果显示,rNcTrx分子量约66 ku,主要以包涵体的形式表达,且纯化效果较好,浓度为0.8 mg/mL。Western blot检测结果显示,纯化的rNcTrx能够与鼠His MAb、新孢子虫感染的小鼠血清发生特异性反应,在66 ku处出现特异性条带。本研究首次经PCR扩增NcTrx基因,对NcTrx基因及其蛋白进行了生物信息学分析,并经原核系统表达及鉴定了NcTrx蛋白,为后续深入探究该蛋白的生物学功能提供参考依据。

我国国家级寄生虫病防治科研基地建设现状与挑战

为提升我国寄生虫病防治工作能力和科研水平,探索寄生虫病防治新策略及适宜技术,中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)自2010年起陆续在各省设立了血吸虫病、疟疾、包虫病等寄生虫病防治科研基地。本文回顾了“十三五”时期寄生虫病防治科研基地建设进展,总结基地工作取得的成果及经验,分析基地可持续发展面临的挑战,并就今后工作提出针对性建议。

日本血吸虫带电多泡体蛋白5的生物学特性研究

目的克隆、表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)带电多泡体蛋白5(CHMP5),并对其生物学特性进行研究。方法利用PCR扩增S.japonicum CHMP5基因目的片段,构建重组质粒pET28a(+)-CHMP5,并对该基因进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR检测CHMP5在不同时期虫体中的转录水平。对体外表达的重组CHMP5蛋白进行纯化与质谱鉴定,并通过Western blotting检测其反应原性。利用免疫组化实验分析CHMP5在虫体中的分布。以小鼠为动物模型,评估重组CHMP5蛋白抗日本血吸虫病的免疫保护效果。结果S.japonicum CHMP5的开放阅读框为675 bp,编码224个氨基酸,具有6个B细胞抗原表位;主要定位于S.japonicum虫体的体被上。CHMP5基因在35 d和42 d虫体中的转录水平高于其它检测时期,且42 d雌虫中的转录水平约是42 d雄虫的3倍。克隆表达的重组CHMP5蛋白其理论分子量约为29 kDa,具有较好的反应原性;用其免疫小鼠24 d,即可使小鼠产生较高水平的IgG抗体,并最终诱导产生18.96%的减虫率和42.98%的肝脏减卵率。结论成功克隆、表达了S.japonicum体被蛋白CHMP5,其在不同发育时期虫体中均有表达,获得的重组CHMP5蛋白可诱导小鼠产生部分的免疫保护效果,为深入探讨S.japonicum CHMP5的生物学功能提供了基础。

我国重点寄生虫病疫情形势及防控工作重点

经过70余年有效防治,我国重点寄生虫病防治工作成效显著,正向控制和消除目标迈进。本文分析了近年来我国血吸虫病、疟疾、棘球蚴病、内脏利什曼病、华支睾吸虫病和土源性线虫病等重点寄生虫病的疫情形势和面临的挑战,提出了下一步工作方向和重点任务,为加快推进全国重点寄生虫病控制和消除进程提供参考。

全国疾控机构重点寄生虫病防治能力建设现状分析

目的了解全国疾病预防控制机构(简称疾控机构)重点寄生虫病防治队伍建设现状、技术需求,并提出针对性改进建议。方法采用线上问卷调查方式,对全国省、市、县级疾控机构和寄生虫病/血吸虫病防治机构开展寄生虫病防治专业人员基本情况、实验室检测能力、技术培训及队伍建设需求等调查,使用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析。结果共有1855个省、市、县级疾控机构参与调查,在岗人员共122282人,其中参与寄生虫病防治工作的人员(简称寄防人员)共计8943人,占全部在岗人员的7.31%(8943/122282);专职寄防人员4745人,占寄防人员的53.06%(4745/8943)。参与调查的疾控机构中,东部地区高级职称及研究生学历占比(19.92%、13.52%)均高于中部(17.02%、8.29%)和西部(13.88%、8.25%)地区(χ^(2)=1063.60、2892.89,P<0.01);东部地区寄防人员高级职称及研究生学历占比(21.20%、12.51%)也高于中部(15.63%、7.30%)和西部(11.62%、6.57%)地区(χ^(2)=142.19、314.93,均P<0.01)。各级疾控机构寄防人员日常工作侧重不同,近一年开展的对下一级寄生虫病防治业务培训2207次,省级机构平均2.7次,地市级平均1.4次,县级平均1.1次。省、市、县3级分别有12.50%(4/32)、34.02%(83/244)和49.02%(774/1579)的疾控机构未设有寄生虫病专用实验室。在血吸虫病、棘球蚴病和内脏利什曼病重点流行省(直辖市、自治区),掌握各病种检测能力的机构占比分别为55.90%(398/712)、40.22%(218/542)和14.55%(117/804),均高于非流行省(直辖市、自治区)(29.83%、7.77%、6.95%)(χ^(2)=124.36、283.05、28.67,均P<0.01)。各级疾控机构对寄生虫病防治工作需求相对集中在人员业务培训(34.61%,642/1855)、诊断检测技术(12.40%,230/1855)和经费设备投入(5.44%,101/1855)等方面。结论全国疾控机构寄生虫病防治能力不平衡,应继续优化寄生虫病防治人员结构、加强业务培训和实验室检测能力建设,为控制和消除寄生虫病提供人才队伍保障。

我国重要人体寄生虫病防控现状与挑战

中国的寄生虫病防治成就举世瞩目。在全球率先消除了淋巴丝虫病;2021年消除疟疾,并获世界卫生组织正式认证;多地血吸虫病已达到消除或传播阻断标准;土源性线虫感染率降到了历史新低,全国处于低度流行状态,但总感染人数仍有千万之多,危害依然严重;华支睾吸虫病等食源性寄生虫病给中国的食品安全带来巨大威胁;虫媒寄生虫病、人兽共患寄生虫病等虽在一定程度上得到了控制,但疫情仍有反复;机会性寄生虫病在免疫功能低下人群中的发病率有所增长,输入性寄生虫病病例也有增多趋势。文章回顾分析了中国重要人体寄生虫病防控成效,梳理了重要人体寄生虫病流行现状,并分析寄生虫病防控所面临的风险与挑战,以期为新时期寄生虫病防控策略与措施的制订提供科学依据,为临床寄生虫病诊治提供流行病学参考数据。

我国重要食源性寄生虫病的流行和控制

华支睾吸虫病、带绦虫病和囊尾蚴病、并殖吸虫病、片形吸虫病、广州管圆线虫病、弓形虫病等是我国重要的食源性寄生虫病。本文介绍了上述寄生虫病在我国的流行和控制状况,并探讨进一步控制的挑战及应对策略。

肉牛羊消化道寄生蠕虫耐药性研究进展

由于长期使用种类有限的体内驱虫药物,世界范围内肉牛羊消化道寄生蠕虫耐药性问题日益严重。本文概述了国内外肉牛羊消化道寄生蠕虫耐药性的现状及其产生机制,从基因突变、生存压力和药物使用等因素,分析了耐药基因频率升高的原因;总结了粪便虫卵减数试验、体外检测试验和分子检测等检测方法的优缺点,为科研和生产实践中的寄生蠕虫耐药性检测提供了参考;提出了科学用药建立“避难所”、研发新型驱虫药物、加强饲养管理等缓解耐药性形成的可行性措施。本文旨在引起肉牛羊产业对消化道寄生蠕虫耐药性的重视,并为精准高效进行耐药性检测和逐步减缓肉牛羊消化道寄生蠕虫耐药性提供依据,从而提升肉牛羊科学健康养殖水平,进一步推动肉牛羊产业高质量发展。

寄生虫获得性感染病原实验室消毒方法的调查研究

目的探讨寄生虫获得性感染病原实验室消毒方法,为实验室人员开展寄生虫相关工作提供指导。方法通过文献检索收集,基于实验室的一般消毒方法,重点对实验室获得性寄生虫感染的病原消毒方法进行分析归纳,通过文献检索形成调研访谈提纲,并对相关病原实验室操作人员开展访谈,初步获得相关寄生虫病原实验室消毒情况。结果寄生虫获得性感染病原实验室消毒方法的文献检索结果与访谈结果有部分相符,访谈人员并未按寄生虫感染阶段进行选择合适消毒剂,基本以75%乙醇、紫外线及压力蒸汽灭菌为主,二氧化氢使用率较低,为7.69%。消毒剂以现配现用为主,消毒频率以每次实验结束后开展为主。基本开展了压力蒸汽灭菌设备的灭菌效果监测,但化学试剂和紫外线消毒效果评价相对欠缺,其消毒效果监测尚需开展,寄生虫病原消毒方法效果是否合适并未做适用性评价。结论目前寄生虫获得性感染病原实验室的消毒方法,以75%乙醇、紫外线及压力蒸汽灭菌为主,各种消毒和灭菌方法的适用性尚未明确,因此需加强相关病原消毒剂研究和相关业务的培训,选择安全合适的消毒剂,防止实验室获得性感染的发生。

一例海豚源典型异尖线虫形态观察和分子鉴定

旨在鉴定由海豚粪便样本中所分离所得线虫种类。首先对所分离虫体进行形态观察,然后提取虫体基因组DNA,并对样本28S rRNA D2-D3基因和ITS基因片段进行PCR扩增,以进行分子生物学鉴定。所得序列经BLAST比对并用邻接法构建系统进化树对所得序列进行分析。结果显示:虫体长120~140 mm,整体呈圆柱形,两端尖细,外观呈乳白色半透明,镜下观察其内部偏黄。可见食道前端细,向后逐渐膨大。PCR结果显示,28S rRNA D2-D3基因与ITS基因扩增长度分别为797和840 bp。BLAST比对结果显示:28S rRNA D2-D3基因(GenBank登录号OR345165)与已报道典型异尖线虫(Anisakis typical, GenBank登录号HF911524.1)的序列一致性为95.36%;ITS基因(GenBank登录号OR345164)与典型异尖线虫(GenBank登录号MF668919.1)一致性为97.11%,其中,ITS-1区域与典型异尖线虫(GenBank登录号MF668919.1)一致性为91.90%,ITS-2区域与典型异尖线虫(GenBank登录号JN968938.1)一致性为94.97%,5.8S rRNA区域与典型异尖线虫(GenBank登录号OQ244221.1)一致性为100.00%。基于ITS基因和28S rRNA D2-D3基因的系统发育分析结果显示,此次研究分离所得寄生虫样本与典型异尖线虫遗传距离最近,且同一分支上。本次分离所得寄生虫样本经过分子鉴定为典型异尖线虫。同源性分析结果显示,其与典型异尖线虫一致性均大于95%;同时,在28S rRNA D2-D3基因序列和ITS基因序列的系统发育分析方面,均与已报道的典型异尖线虫遗传距离最近。

《野鼠血吸虫感染情况监测工作方案(2024年版)》解读

2024年4月7日,中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)下发了《野鼠血吸虫感染情况监测工作方案(2024年版)》。该方案是国家疾病预防控制局联合多部门于2023年6月印发的《加快实现血吸虫病消除目标行动方案(2023—2030年)》的配套技术方案之一,其目的是将上述行动方案提出的“监测预警响应行动”中的野生动物传染源监测内容具体化,以指导流行区各级血吸虫病防治机构科学、规范地开展该项工作内容。本文就该方案制定的背景与目的、内容与方法以及数据的管理等核心内容进行解读。

基于影像组学与临床实验室指标构建血吸虫病肝纤维化分级诊断模型

目的探索基于B型超声影像与临床实验室指标构建血吸虫病肝纤维化分级诊断模型的可行性。方法收集2018—2022年江西省都昌县第二人民医院血吸虫病患者超声影像及临床实验室数据。以血吸虫病肝纤维化Ⅰ级病例为第1组,Ⅱ级和Ⅲ级病例为第2组;选取2018—2021年病例数据为训练集、2022年病例数据为验证集,构建机器学习二分类模型。采用ITK-SNAP软件标记影像特征,采用Python 3.7编程语言和PyRadiomics工具包提取影像特征。采用t检验或Mann-Whitney U检验比较两组样本间影像特征差异,并采用套索算法(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)进行关键影像特征筛选。采用Scikit-learn机器学习库进行机器学习建模,包括支持向量机(support vector machine,SVM)、随机森林(random forest,RF)、线性回归(linear regression,LR)和极端梯度提升(extreme gradient boosting,XGBoost)等4种模型。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)进行最优机器学习模型筛选,并使用沙普利加和解释(SHapley Additive exPlanations,SHAP)评估对机器学习模型中超声影像鉴别特征贡献度最高的特征。结果2019—2022年,累计将491例血吸虫病患者超声影像和临床实验室检查数据纳入研究。累计提取了851项影像组学特征和54项临床实验室指标,经统计学检验(t=-5.98~4.80,U=6550~20994,P均<0.05)及LASSO回归特征筛选,纳入44项特征或指标进入下一步研究。临床实验室指标SVM机器学习模型训练集和验证集ROC曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.763和0.611,超声影像组学SVM机器学习模型训练集和验证集AUC分别为0.951和0.892,多模态SVM机器学习模型训练集和验证集AUC分别为0.960和0.913。机器学习模型中贡献度居前10位的特征或指标包括2项临床实验室指标和8项影像组学特征。结论超声影像组学和临床实验室指标相结合的多模态机器学习模型可用于血吸虫病肝纤维化智能识别,并可提升单类数据模型的分类效果。

2023年青海省隆宝滩棘球绦虫虫卵污染情况调查

目的了解青海省隆宝滩地区棘球绦虫虫卵的环境污染情况,为有针对性地制定棘球蚴病防治措施提供依据。方法2023年3—4月,在青海省玉树市隆宝镇措桑村的养犬户家庭、村内主要街道及野外区域,分别采集犬科动物粪便、动物毛发、水、土壤、草和食物等不同类型的环境样本,利用PCR技术检测样本棘球绦虫虫卵并比较检出率差异。采用ArcGIS软件并结合ASTER GDEM高程数据,制作样本分布高程地图。结果共采集环境样本400份,棘球绦虫虫卵总检出率为13.50%(54/400);其中犬科动物粪便、动物毛发、水、土壤、草、食物的检出率分别为30.43%(42/138)、5.33%(4/75)、15.38%(2/13)、5.26%(6/114)、0(0/37)、0(0/23)。138份犬科动物粪便中,19份野外粪便未能通过PCR鉴定出动物宿主;其余119份样本中,犬、藏狐、赤狐粪便虫卵检出率分别为11.29%(7/62)、48.84%(21/43)、50.00%(7/14),差异有统计学意义(χ^(2)=20.481,P<0.05)。138份犬科动物粪便中,细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫虫卵检出率分别为2.17%(3/138)、18.12%(25/138)和16.67%(23/138),差异有统计学意义(χ^(2)=19.858,P<0.05)。75份动物毛发样本中,犬、牛的毛发检出率分别为6.06%(4/66)、0(0/9),差异无统计学意义(P>0.05)。13份水样本中,野外河流溪水、村内井水和村内积水的虫卵检出率分别为20.00%(2/10)、0(0/2)和0(0/1),差异无统计学意义(P>0.05)。114份土壤样本中,养犬户家庭、村内主要街道和野外土壤虫卵检出率分别为15.00%(3/20)、15.00%(3/20)和0(0/74),差异有统计学意义(P<0.05)。动物毛发、水和土壤样本中检出的虫卵均为细粒棘球绦虫。在虫卵分布方面,检出虫卵的犬科动物粪便高度集中于野外道路附近地域,其他环境检出虫卵的样本无明显集中趋势。结论青海隆宝滩地区环境虫卵污染严重且分布广泛,需继续采取犬(特别是未拴养犬)及野外传染源(狐狸)驱虫等防控措施,以减少棘球绦虫虫卵对环境的污染,降低棘球蚴病传播风险。

基于高通量测序的家犬粪便寄生虫病原调查

目的调查大兴安岭地区家犬寄生虫感染情况,为当地人兽共患寄生虫病的防控提供参考。方法于2020年9月在大兴安岭地区加北村、白桦村、东山村、图强镇、幸福村和古源镇等6个自然村的养犬户院内收集新鲜家犬粪便,提取粪样总DNA,使用顶复门(Apicomplexa)、阿米巴属(Amoeba)、双滴虫目(Diplomonadida)、动质体目(Kinetoplastida)、毛滴虫属(Parabasalia)、线形动物门(Nematoda)、扁形动物门(Platyhelminthes)和小孢子虫目(Microsporidia)等8个分类学群的13对寄生虫通用引物进行PCR扩增,扩增产物经高通量测序后获得目的基因片段,产物序列在NCBI数据库中进行比对分析以鉴定虫种,统计家犬粪便的寄生虫检出率。结果202份家犬粪便中有37份检出寄生虫DNA,寄生虫总检出率为18.32%。共计检出7个门15个科的19种寄生虫,不同虫种检出率差异具有统计学意义(χ^(2)=69.488,P<0.05)。检出原虫13种,蠕虫6种。其中,以原虫眼虫门动质体纲Parabodonida科的Parabodo caudatus检出率最高,为6.44%(13/202)。在37份检出寄生虫DNA的样品中,混合检出阳性占比为32.43%(12/37),其中检出1种寄生虫的占72.97%(27/37),同时检出2种、3种、4种寄生虫的分别占27.03%(10/37)、0.27%(1/37)和0.27%(1/37)。家犬粪便寄生虫DNA检出率以加北村最高,为37.70%(23/61),其次为图强镇,检出率为36.36%(20/55),白桦村未检出(0/13)。不同采样点的检出率差异具有统计学意义(χ^(2)=19.717,P<0.05)。结论大兴安岭地区家犬体内存在多种寄生虫感染,且部分地区检出率较高,当地居民存在一定的犬源性寄生虫感染风险。

检测棘球蚴病患者血清内循环抗原的免疫层析试条的制备和评价

目的以棘球蚴囊液纯化抗原特异性单克隆抗体为基础建立一种快速、简便诊断棘球蚴病的胶体金免疫层析试条方法,并对其进行评价。方法纯化棘球蚴囊液抗原,并以此免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价。筛选基于棘球蚴囊液纯化抗原制备的单克隆抗体对,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记筛选到的单克隆抗体,并将其吸附于交联垫;将另一筛选到的单克隆抗体划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置,制成免疫层析试条。用该试条检测手术确诊的细粒棘球蚴病(87例)、多房棘球蚴病(40例)、囊尾蚴病(25例)、日本血吸虫病(10例)、弓形虫病(5例)、并殖吸虫病(5例)、华支睾吸虫病(5例)患者血清,以及60例健康者血清,以评价其检测的敏感性和特异性。结果以棘球蚴囊液纯化抗原为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了11株能高效分泌效价在1∶25600~1∶102400特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG_(1)或IgG_(2)a。筛选到的单克隆抗体F 3B 6作为标记抗体,单克隆抗体C 4H 6作为包被抗体制成免疫层析试条,用该试条检测127份棘球蚴病患者血清的敏感性为88.12%(112/127),其中试条检测囊型包虫病患者血清的敏感性为88.51%(77/87),检测泡型包虫病患者血清的敏感性为87.50%(35/40),试条法检测两型包虫病患者血清敏感性之间差异无统计学意义(χ^(2)=0.03,P=0.86)。与25份囊尾蚴病患者血清、10份日本血吸虫病患者血清、5份弓形虫病患者血清、5份并殖吸虫病患者血清和5份华支睾吸虫病患者血清均无交叉反应,60份健康者血清也均为阴性,总特异性为100.00%。结论成功制备了棘球蚴囊液纯化抗原的单克隆抗体,以此单抗为基础研制出的快速诊断棘球蚴病胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高。

利什曼原虫K26基因的克隆、表达及用于我国内脏利什曼病特异性抗体检测的效果评价

目的克隆并表达分离于我国3种类型的利什曼原虫K26基因,并用其检测我国内脏利什曼病特异性抗体,同时进行效果评价。方法分别将我国新疆喀什(KS-6株)、四川九寨沟县(SC6株)和新疆伽师县(JIASHI-1株)K26基因进行全基因合成并加入Bam H I与Xho I酶切位点,分别将K26基因连接至双酶切的pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化重组蛋白。用制备的3种抗原分别作为包被抗原,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病原学确诊的内脏利什曼病患者及其它寄生虫病患者和健康者的血清中和抗体,以评价其检测的敏感性和特异性。用美国InBios公司rK39试条进行平行检测,比较3种抗原检测的敏感性。结果成功构建利什曼原虫pET32a-K26重组质粒,并在原核细胞中成功表达。以KS-6株、SC6株、JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白为包被抗原的ELISA法和rK39试条法检测黑热病患者血清的敏感性分别为90.00%(99/110)、92.73%(102/110)、90.91%(100/110)和93.64%(103/110),共检测45份其他寄生虫病患者(包括日本血吸虫病、疟疾、细粒棘球蚴病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和弓形虫病)的血清均无交叉反应,健康者血清(40份)也无假阳性反应,特异性均为100.00%。KS-6株、SC6株和JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白ELISA法和rK39试条法的阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2)_(KS)-6=0.97,P=0.33;χ^(2)_(SC6)=0.07,P=0.79;χ^(2)_(JIASHI)-1=0.57,P=0.45)。3种K26抗原的阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2)=0.53,P=0.97)。结论重组K26抗原在内脏利什曼病诊断上具有潜在的应用价值。

一种同时检测4种山羊肠道寄生虫多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立一种可同时检测十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫等4种山羊肠道寄生虫的多重PCR检测方法,并初步评估其检测效能。方法基于GenBank中十二指肠贾第虫(GenBank登录号:XM_001710026.2)、微小隐孢子虫(GenBank登录号:XM_626998.1)、毕氏肠微孢子虫(GenBank登录号:KJ719492.1)和莫尼茨绦虫(GenBank登录号:OM296991.1)相应基因的保守序列设计4对特异性引物,建立并优化可同时检测上述4种寄生虫的多重PCR方法。2022年10—12月,从广东省湛江市4个山羊养殖场采集116份新鲜山羊粪便样本,其中96份用于所建立多重PCR方法的检测效能评价、20份作为样本检测的本底对照。分别采用单病原PCR检测方法及本研究所建立的多重PCR方法,对96份山羊粪便DNA样本进行检测。以单病原PCR检测结果为金标准,计算多重PCR法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果本研究所建立的多重PCR方法可同时扩增出十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫特异性基因片段,其大小分别为1400、755、314 bp和585 bp,检出限为≥102拷贝数的病原DNA克隆质粒;该方法对日本血吸虫、羊前后盘吸虫、细粒棘球绦虫、芽囊原虫和平腹吸虫基因扩增结果均为阴性。采用单病原PCR和所建立的多重PCR方法检测96份山羊粪便DNA样本,40份(40/96,41.67%)粪便DNA经单病原PCR检测出现阳性扩增产物,其中39份经多重PCR检测亦出现阳性扩增产物,平均符合率为97.50%(39/40)。96份样本中,多重PCR方法分别检出十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫、莫尼茨绦虫感染阳性26(27.10%)、22(22.90%)、24(25.00%)、9份(9.40%),与单病原PCR检测结果一致。以单病原PCR检测结果为金标准,多重PCR法对山羊粪便样本中十二指肠贾第虫、毕氏肠微孢子虫、微小隐孢子虫和莫尼茨绦虫DNA检测灵敏度分别为96.15%、95.83%、100.00%、100.00%,阴性预测值分别为98.90%、98.92%、100.00%、100.00%,阳性预测值均为100.00%。结论本研究建立了一种可同时检测十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和莫尼茨绦虫等4种山羊常见寄生虫的多重PCR方法,该方法灵敏度高、特异性好,适用于大规模羊群粪便样本快速筛查。

CRISPR/Cas系统在寄生虫基因编辑与核酸检测中的应用进展

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)系统(CRISPR/Cas系统)为具有规律簇状短回文重复序列结构的适应性免疫系统,能干扰外源性核酸,保护原核生物免受外部侵害,是一种有效的基因编辑及核酸检测工具。CRISPR/Cas系统在病毒和细菌领域应用广泛,但在寄生虫病领域研究相对较少。本文分类探讨了CRISPR/Cas系统的作用机制,全面综述了其在寄生虫基因编辑与核酸检测中的应用,旨在为未来寄生虫病相关研究提供参考。