生物安全三级实验室2种防护型口罩的定量适合性测试比较

目的:对2种防护型口罩(3M1860杯状、3M9332折叠型)进行定量适合性检测,为实验人员合理选择防护型口罩提供依据。方法:使用Model8038型口罩定量适合性检测仪,检测68名实验人员对这2种防护型口罩的适合性,并对每种防护型口罩在检测时规定动作的适合性因子数进行统计学分析。结果:68名测试人员中,有49人通过3M1860适合性检验,41人通过3M9332适合性检验。在不同及相同动作下,规定动作对2种防护型口罩适合性通过率均无差异(P>0.05)。对2种防护型口罩的68次适合性检测的规定动作进行适合性因子分析,发现3M1860杯状口罩除深呼吸(P=0.567)对其初次佩戴口罩适合性的影响无差异外,其他动作(左右转头、低头抬头、说话、弯腰)均对其适合性影响有差异(P<0.050);3M9332折叠型口罩,说话(P=0.000)及弯腰(P=0.000)对初次佩戴口罩适合性的影响有差异,其他动作(深呼吸、左右转头、低头抬头)对其适合性影响无差异。结论:在口罩定量适合性检测通过的情况下,根据每一项动作的适合性因子数,选择适合自己实验活动的防护型口罩,提高口罩的防护效果,保障实验人员的安全。

我国肾综合征出血热流行现状与预防控制

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是我国重点防治的乙类传染病,曾在我国广泛流行,给人民群众健康带来严重威胁。多年来,在政府主导多部门通力协作全面落实综合防控措施的背景下,HFRS得到有效控制,发病总体上进入低水平波动期,但累及地区却在扩大,新的疫源地仍在出现,部分疫源地疫情时有反复,防控工作面临新的形势。进一步巩固防控成果,降低发病率和病死率,仍是当前公共卫生系统亟待解决的挑战之一。为此,本文介绍了HFRS的病原学特征,结合既往疫情资料分析了我国当前HFRS的流行特点,总结了我国HFRS的防控策略与措施,以期为新形势下我国HFRS的防控工作提供有益参考。

应用篮式生物反应器在BSL-3实验室进行病毒培养的评估

目的对篮式生物反应器在BSL-3实验室进行高致病性病毒培养的风险点加以评估,通过对病毒接种、培养、收获3个阶段环境中病毒浓度的监测判断其在BSL-3实验室病毒培养的安全性。方法用灭菌的拭子在病毒的接种、培养、收获3个阶段对篮式生物反应器的罐体及连接处进行涂抹采样,同时在安全柜中,用AirPort MD8空气采样器对病毒的接种和收获操作过成进行空气采样,并且对在3个阶段操作后,实验人员的个人防护装备进行涂抹采样,3种方式进行监测。结果在病毒接种、培养、收获3个阶段,篮式生物反应器的罐体及连接处采样病毒检测结果均为阴性,在病毒接种和收获操作过程中的空气采样病毒检测结果均为阴性,实验人员个人防护装备采样的病毒检测结果均为阴性。结论在BSL-3实验室采用篮式生物反应器进行病毒培养的方法是安全可靠的,通过检测结果显示其在整个操作过程中,未有病毒的泄露,进而确保了实验人员和实验室内环境的生物安全。

新型冠状病毒Beta变异株感染C57BL/6小鼠肺组织转录组分析及趋化因子实验验证

研究旨在通过从转录组水平分析新冠病毒Beta变异株感染C57BL/6小鼠肺部的基因表达变化,以揭示引发轻症肺部损伤的关键宿主因子。首先构建Beta变异株感染C57BL/6小鼠模型,并对感染和未感染第3天(3d)小鼠的肺组织进行病原检测、病理分析以及差异表达基因分析。最后,筛选可能导致肺部损伤的5个炎症反应关键基因进行RT-qPCR验证。研究结果显示Beta变异株能感染C57BL/6小鼠肺部并导致轻度病理损伤。在感染的小鼠中,Beta变异株激活了肺组织的天然免疫应答,主要通路包括Toll样受体信号通路、Ⅰ和Ⅱ型干扰素反应、白细胞趋化反应和细胞因子反应等。通过对重症与轻症感染小鼠的肺组织转录组比较,筛选出与疾病严重程度相关的炎症反应趋化因子,包括Ccl2、Ccl7、Cxcl9、Cxcl10和Cxcl14。通过RT-qPCR验证,基因表达变化趋势与转录组结果一致,表明这些趋化因子过度激活与肺部病理表型损伤程度相关。本研究揭示了Beta变异株感染小鼠肺部激活宿主炎症反应通路关键因子,可能是引发小鼠肺部轻度病理损伤的主要诱因之一,这为预防和治疗新冠病毒感染提供了有利的研究靶点。

2020年西藏自治区0~5岁健康儿童肠道病毒的流行和分布

目的研究中国西藏自治区2020年0~5岁健康儿童中人肠道病毒的流行和分布。方法粪便标本取自2020年中国西藏自治区574名0~5岁的健康儿童。使用实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测粪便标本中的肠道病毒核酸。对肠道病毒核酸阳性的标本,采用逆转录PCR扩增肠道病毒VP1区并进行序列测定和分析,根据测定的序列进行肠道病毒分子分型。结果574例样本中检出肠道病毒(enterovirus,EV)核酸阳性89份(15.98%),EV-B检出最多,检出率为10.98%,EV-A和EV-C检出率分别为3.66%和0.87%,未发现EV-D。共鉴定出17种血清型,主要血清型为E11(7.67%),其次为EV-A71(1.74%)。各年龄组感染率存在一定的差异,呈现为随着年龄的增大感染率逐渐降低的现象,0岁和1岁组感染率分别为23.4%和25.0%,而在5岁组感染率降为最低,仅为5.8%。结论西藏自治区健康儿童粪便样本EV病原谱中以EV-B为主。序列分析提示了西藏自治区EV流行的广泛性及多样性,以EV-A71和E11为代表的几种EV型别在西藏自治区相对常见,有导致较严重疾病的潜力,需要进行更加严格的监测。

2020年西藏自治区0~5岁健康儿童携带埃可病毒11型的基因特征分析

目的本研究旨在通过对2020年西藏自治区5岁以下健康儿童中携带埃可病毒11型(echovirus11,E11)的基因特征进行研究,掌握肠道病毒的流行情况,填补西藏自治区关于E11基因特征研究的空白。方法收集2020年在中国西藏自治区内采集的0~5岁健康儿童的粪便标本,通过病毒分离和肠道病毒分子定型方法,对阳性病毒分离物进行肠道病毒血清型鉴定,并对鉴定结果为E11的病毒分离物进行全长VP1区扩增及核苷酸序列测定和分析。使用MEGA软件构建基因进化树(最大似然法),与中国其他省份E11和全球E11进行遗传进化分析。结果574份粪便标本中分离到89株肠道病毒分离株,其中E11有44株,是主要的血清型,VP1区核苷酸序列之间的相似性为96.4%~100%,在系统发育树上呈现为多个传播链,但均属于D5基因亚型,且与我国2017年后其它省份E11流行株聚为一簇。结论本研究获得了我国西藏自治区流行的E11的基因特征的基本信息,并了解了全球E11的基因型分布。

公卫先行“十三五”国家传染病重大专项助力健康“一带一路”——“‘一带一路’重要传染病流行规律和预警应对技术研究”项目简介

"一带一路"倡议为中国和沿线国家经济发展带来机遇的同时,也给公共卫生带来新的挑战。为了切实应对"一带一路"公共卫生的挑战,降低"一带一路"倡议实施伴随的传染病传播风险,由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所牵头的"‘一带一路’重要传染病流行规律和预警应对技术研究"项目获得了"十三五"国家科技重大专项资助。该项目由王文玲研究员作为项目总负责人,汇集了我国新发突发传染病防控的17家优势单位,将围绕5个方面开展相关研究,包括:①"一带一路"重要传染病流行特征研究;②"一带一路"重要病媒生物携带病原体研究;③"一带一路"重要传染病输入风险和监测预警技术研究;④"一带一路"重要传染病协同防控关键技术研究;⑤"一带一路"重要传染病实验室保障技术研究。该项目实施将切实将传染病防控的关口前移,服务国家"一带一路"大卫生概念的现实需求,坚持推动"构建人类命运共同体"。

表达分泌荧光素酶的重组流感病毒构建及体外生物学特性研究

目的采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)的重组流感病毒,同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide,P2A)自剪切位点及Gluc编码基因,其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8)(H1N1)和A/WSN/1933(WSN)(H1N1),通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒,分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性;对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度;检测重组病毒的生长动力学;同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID_(50))的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。结果通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架,以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定,复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID_(50)有较好的相关性,其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。结论以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高,为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。

两种直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度的验证

目的对检测狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)滴度的荧光灶单位(Fluorescent focus unit,FFU)法和半数荧光灶数量(50%fluorescent focus infectious dose,FFD50)法两种直接免疫荧光法进行验证。方法应用FFU法和FFD50法检测RABV不同毒株滴度,计算FFU值和FFD50值的变异系数(Coefficient of variation,CV),验证可靠性(精密度和稳定性);与标准的小鼠脑内滴定法测定的半数致死量(50%lethal dose,LD50)值进行比较,验证准确性和线性范围。结果日间精密度和中间精密度验证显示,FFU法和FFD50法测定的CVS-11 RABV毒株滴度FFU值和FFD50值的CV均<30%;稳定性验证显示,在改变细胞-病毒孵育时间、丙酮固定时间和染色时间后,两种方法测定的CVS-11毒株滴度FFU值和FFD50值的CV均<30%。准确性验证显示,FFU法和FFD50法测定的CVS-11、SC16、GD1、QH2 RABV毒株滴度FFU值和FFD50值与小鼠脑内滴定法测定的LD50值均接近;病毒稀释倍数在5-1至5-7范围内,FFU和FFD50与其呈线性关系,线性回归方程分别为y=-1.350x+7.391(R2=0.991)和y=-1.453x+8.285(R2=0.980)。结论FFU法和FFD50法检测RABV滴度均具有良好的可靠性和准确性,为替代小鼠脑内滴定法提供了支持。

2012-2023年882例重症手足口病病例病原谱及CV-A6基因特征分析

为了解重症手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)病原谱变化情况以及重症HFMD相关柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6, CVA6)的基因特征,本研究收集了2012-2023年各省级HFMD监测网络实验室送检的882份重症HFMD病例病毒分离物,通过扩增病毒的VP1编码区进行分子分型以确定肠道病毒的血清型,并对其中的CVA6进行全长VP1区扩增和核苷酸序列测定分析,进行最大似然法系统进化树和氨基酸置换熵值等生物信息学分析。结果发现,2018年开始,以CVA6和CVA10为主的肠道病毒逐渐取代EV-A71和CV-A16成为导致重症HFMD的主要病原体,在每年检出的病原体中的比例均超过50.0%。除2013年重症HFMD中分离的CVA6属于D2基因亚型外,2013年后重症HFMD中分离的CVA6均属于D3a基因亚型,但2019年以后分离的CVA6序列与以往分离株序列的进化距离明显增大。此外,针对氨基酸位点的置换熵值研究表明,参与构成构象表位的VP1-283易发生突变,该位点从2017年开始由亲水的苏氨酸突变成疏水的丙氨酸,导致其可能分别与VP3-57N、VP3-66R之间形成氢键,这可能会影响到病毒的感染过程。本研究明确了2012-2023年中国重症HFMD病原谱的变化特征,探究了导致重症HFMD的CVA6的进化特点以及重要氨基酸变异特征,为重症HFMD的预防控制策略的制定提供了理论依据。

广谱抗病毒药物吐根碱抑制HCoV-OC43的转录组分析

本研究旨在探索吐根碱对人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43, HCoV-OC43)的作用时相和抗病毒机制。首先,在MRC-5细胞上建立了HCoV-OC43病毒的体外感染复制动力学曲线,测定了药物的EC_(50)和CC_(50)。结果表明吐根碱能够在感染早期有效地抑制HCoV-OC43病毒在MRC-5细胞中的复制。通过转录组分析,发现HCoV-OC43感染和吐根碱处理均导致宿主基因表达的紊乱,并且两者共同激活了抗病毒通路。吐根碱可能通过激活OASL、Mx1和IFIT2等抗病毒基因来增强宿主对病毒的抵抗能力。此外,吐根碱还可能通过抑制TMEM41B表达而进一步影响病毒复制过程。这些研究结果为深入探究吐根碱作为抗冠状病毒药物的机制和潜在靶点提供了重要线索。

基于新一代测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株全基因组序列及其开放阅读框组成

目的应用新一代长读长测序技术精准确定复制缺陷型痘苗病毒天坛株(non-replicating Tiantan strain of vaccinia virus,NTV)全基因组序列及其开放阅读框(ORFs)组成。方法基于本实验室储备的NTV,在鸡胚成纤维细胞上进行扩增并纯化,提取NTV全长基因组核酸。PacBio HiFi测序从头组装获取NTV全长基因组序列。以同源注释的策略确定其ORF组成,并分析其与已知复制缺陷型痘苗病毒毒株ORF异同。结果NTV全长共171729 bp,GC含量为33%,其独特的倒置末端重复(ITR)区域包含发夹结构、两个串联重复区域及3个非重复区域。NTV共有166个ORFs,与第三代天花病毒疫苗改良安卡拉株(MVA-BN)和复制缺陷型哥本哈根株(NYVAC)株相比,主要差异位于ITR及其周围区域,3个毒株共同享有138个ORFs,NTV特有6个编码与病毒逃避宿主抗病毒反应相关的ORFs。结论通过三代测序技术精准确定NTV全基因组序列及ORFs组成,并揭示其与其他复制缺陷型痘苗病毒毒株的异同,为新一代猴痘疫苗和痘苗病毒载体研发应用提供重要参考。

甲型流感病毒H1N1血凝素茎部亚单位疫苗与不同佐剂组合在小鼠中诱导的免疫应答与保护

通过真核表达系统表达并纯化流感病毒H1N1血凝素(Haemagglutinin,HA)茎部,将其与不同佐剂联合免疫小鼠,评价其免疫原性及攻毒保护效果。本研究以密码子优化且结构修饰的甲型流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)的HA茎部为目的基因构建真核表达质粒pcDNA3.1‐MiniHA(H1),转染HEK‐293T细胞,通过镍离子亲和层析柱纯化Mini‐HA。将Mini‐HA分别与Al(OH)_(3)、Al(OH)_(3)+CPG ODN、AddaS03^(TM)三种佐剂联合免疫小鼠,通过ELISA、ELISPOT和细胞内因子染色进行体液与细胞免疫检测,以H1N1‐PR8进行攻毒保护试验,监测小鼠存活率、体重变化、肺病毒载量以及肺组织病理变化,评估其保护效果。结果显示,Mini‐HA表达形成三聚体结构,Mini‐HA各组初次免疫后即可检测到针对HA茎部及全长HA的特异性IgG,加强免疫后抗体滴度显著增高;Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN佐剂可以刺激Th1型细胞因子分泌,联合AddaS03^(TM)佐剂可以刺激Th1/Th2型细胞因子分泌;攻毒保护试验中,Mini‐HA联合Al(OH)_(3)+CPG ODN或AddaS03^(TM)佐剂组小鼠存活率达100%,体重下降低于5%,其中Mini‐HA联合AddaS03^(TM)佐剂组肺组织结构完整,仅见小部分肺泡腔代偿性扩张以及少量淋巴细胞浸润。本研究成功纯化了HA茎部蛋白Mini‐HA,联合佐剂免疫小鼠具有良好的免疫原性,以AddaS03^(TM)佐剂效果最好,可以诱导产生特异性体液与细胞免疫应答,保护小鼠抵御H1N1‐PR8流感病毒的攻击,有效抑制病毒复制、减少肺组织病理损伤。

检测痘苗病毒体外感染的病灶形成方法的优化与应用

本研究旨在建立一种快速、通用、高通量的病灶形成测定法(Focus-forming assay, FFA),用于痘苗病毒(Vaccinia virus, VACV)的研究。首先采用经典噬斑染色法与免疫噬斑法对不同VACV代表性毒株(Western Reserve strain, WR;Tiantan strain, VTT;Modified Ankara strain, MVA)在BHK-21细胞和Vero细胞上的噬斑特性进行评估,通过实验条件(包括显色液、非特异性染色、细胞培养板和病毒培养时间)的优化,提高病灶的可视化质量和测定的准确性。并基于改进优化的FFA法研究了VACV在BHK-21细胞和Vero细胞上的生长曲线,同时对FFA法的重复性进行了评估。研究发现BHK-21细胞对VACV的感染更加敏感,适宜于多种VACV滴度测定。实验条件的优化显著提高了病灶的可视化质量和测定的准确性。应用FFA法发现WR、VTT和MVA毒株在BHK-21细胞上能够有效复制,而MVA在Vero细胞上的复制受限,且FFA法在同一实验内具有良好的重复性,变异系数在0.17%到3.50%之间。改进后的FFA法是一种快速、通用、高通量的方法,适用于痘苗病毒滴度的测定,为痘苗病毒的研究和应用提供了可靠的技术支持。

表达呼吸道合胞病毒G蛋白胞外区的重组H1N1流感病毒单剂滴鼻免疫可在小鼠诱导强免疫应答与保护

目的基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒,将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后,单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠,并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后,分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒,通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较,免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。

猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白的表达纯化及其在痘苗病毒免疫血清检测中的应用分析

目的表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体,转染HEK293T细胞后收获上清,通过Western blot方法验证蛋白表达,通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白,并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原,通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度,并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后,纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体,三个抗原检测的IgG滴度显著相关,痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关,但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体,且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关,但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘(包括猴痘)病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。

水痘-带状疱疹病毒滴定方法的优化与应用评价

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)病毒滴定方法进行优化,并应用于中和抗体检测和抗病毒药物体外检测。方法采用VZV疫苗株Voka株在48孔板感染人视网膜上皮细胞(adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19),连续7 d检测感染后病毒复制动力学与蚀斑特点;分别建立并优化活病毒滴定的蚀斑染色法和酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT),同时对两种方法检测结果的相关性进行分析,并将改进后的方法应用于VZV药物抑制效果检测和血清中和抗体检测。结果VZV感染ARPE-19细胞(感染复数为0.05)后,第6天到达复制顶峰并形成肉眼可见蚀斑;蚀斑染色法中,添加0.2 mg/mL二乙胺乙基葡聚糖(diethylaminoethyl-dextran,DEAE-Dextran)后,较未添加组产生更大与边缘更加清晰的蚀斑。ELISPOT法可在感染后第3天进行计数,同时通过改变检测用抗体与显色液等,可产生更加清晰可计的斑点。两种方法可采用机器计数,检测病毒滴度或应用于体外检测抗VZV药物效力与血清中和抗体滴度,具有良好的相关性。结论优化后ELISPOT法快捷灵敏,可替代蚀斑染色法应用于VZV病毒滴度检测与相关应用。本研究为VZV的检测及疫苗药物研发提供了更简捷可靠的实验方法。

柯萨奇病毒A组6型对利巴韦林耐药性的初步研究

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)已成为近年来国内导致手足口病的主要病原体。本研究挑选16株中国流行的不同基因亚型的CVA6,通过在RD细胞上的细胞活性实验和观察致细胞病变效应来检测利巴韦林对不同CVA6毒株的抑制率。结果表明药物浓度在0.8mmol/L和0.4mmol/L作用下对部分CVA6有明显的抑制作用(P<0.0001),在0.8mmol/L药物浓度下根据抑制率的高低,将抑制率大于80%的CVA6株(5株,占31.25%)以及低于10%的CVA6株(5株,占31.25%)分别定义为对利巴韦林敏感组和耐药组。为了探究CVA6耐药性与病毒致病力之间的关系,在利巴韦林敏感组与利巴韦林耐药组分别随机挑选两株CVA6进行ICR乳鼠感染实验。通过观察乳鼠生存率、临床评分和体重变化,结果显示利巴韦林耐药组CVA6致病力均比利巴韦林敏感组弱,表明利巴韦林耐药与致病力之间存在一定联系。最后使用MEGA软件对利巴韦林敏感组和耐药组CVA6进行3D区氨基酸序列比对分析,发现两组CVA6在3D区75位、308位、342位、346位氨基酸完全不同,提示利巴韦林耐药与3D区的基因多态性存在一定联系。本研究提示对利巴韦林耐药的CVA6广泛存在,属于目前优势流行D3a基因亚型,不仅为手足口病患者个体化治疗提供了重要依据,而且对CVA6感染相关疾病的防控具有重要意义。

全球柯萨奇病毒A组6型VP1区进化与正向选择位点分析

目的基于柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus group A type 6,CV-A6)VP1编码区寻找与其流行强度增加有关的关键氨基酸位点。方法对GenBank数据库中全部CV-A6 VP1编码区核苷酸序列进行筛选,获得其中的1533条序列进行比对。使用RAxML软件构建最大似然树。使用Shannon Entropy在线分析工具计算序列的氨基酸置换熵值,并用Datamonkey在线分析平台通过MEME,SLAC和FUBAR三种方法来分析正向选择位点。结果目前全球流行的CV-A6以D3基因亚型为主。在VP1编码区存在三个高度可变的氨基酸位点,分别是VP1-5、VP1-30、VP1-137。三种方法均发现VP1-5、VP1-90、VP1-137三个位点在流行中受到过正向选择的作用。结论应继续加强对D3基因亚型CV-A6的监测,D3基因亚型的CV-A6在位于DE环中的VP1-137高度可变且受到了正向选择的作用,需要加以重视,并通过进一步研究来确定它与D3亚型广泛流行的关系。

2017-2018重庆市手足口病病原谱及主要病原体基因特征分析

目的分析2017—2018年重庆地区手足口病病原谱及其主要病原体的基因特征。方法选择重庆市儿童医院作为研究对象,收集并整理该院区2017—2018年1071例诊断为手足口病患者的核酸检测信息,其中810份已明确了肠道病毒血清型,剩余175份血清型待鉴定,另有86份肠道病毒为阴性。通过病毒分离、核酸浓缩及基因测序等方法对上述261份样本进行鉴定,获得该地区手足口病完整的病原谱。使用MEGA 7.0软件构建四种主要病原体的系统进化树,进行基因特征的研究。结果通过改良的鉴定方法,261份标本中,除3份被鉴定为人副肠孤病毒(Human parechovirus,HPeV)外,其余258份样本均为肠道病毒阳性。其中CVA6(coxsackievirus A6)血清型占比最多,其次为EV-A71(enterovirus A71)另有CVA16(coxsackievirus A16)和CVA10(coxsackievirus A10)以及其他肠道病毒共计13种血清型。系统进化结果显示,重庆市CVA6血清型均为D3a基因亚型,EV-A71、CVA10和CVA16的优势基因亚型分别为C4a,C2b和B1b,这四种优势基因型与全国其他地区的基因型共同循环进化。结论本研究通过优化鉴定方法,提高了肠道病毒的检出率,进一步明确了重庆地区手足口病病原谱构成,CVA6是该地区2017—2018年手足口病的主要病原体,其次是EV-A71,同时这两种血清型也是导致重庆地区重症手足口病主要的病原体。