重组人骨靶向干扰素γ-1b在大肠杆菌中的表达

目的建立人骨靶向干扰素γ-1b的高效原核表达体系。方法从Drug Bank数据库下载人干扰素γ-1b氨基酸序列,在羧基端加上10个天冬氨酸标签作为骨靶向分子。采用大肠杆菌偏爱密码子,DNA Star软件分析获得骨靶向性干扰素γ-1b的基因序列。人工合成基因序列并克隆入pET3c质粒表达载体。将上述pET3c-rhIFNγ-1b-D10重组表达载体转入大肠杆菌BL21,筛选高效表达菌株。分离包涵体,8mol/L尿素溶解,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。Western blot检测目的蛋白的特异性表达。结果测序结果显示所克隆的骨靶向rhIFNγ-1b基因序列正确,筛选出高效表达菌株。经SDS-PAGE显示在相对分子质量19KD处出现特异的目的蛋白表达带,表达量约占全菌蛋白的30%。表达产物以包涵体形式存在,8mol/L尿素变性后经镍柱亲和层析纯化,纯度大于90%,浓度为0.8mg/mL。Western检测显示在19KD处出现特异性目的条带。结论成功在大肠杆菌中表达了人骨靶向干扰素γ-1b,为研究其生物学活性及用于骨硬化症的治疗奠定基础。

重组人骨靶向干扰素γ的骨靶向性和对巨噬细胞向破骨细胞分化的影响

目的对重组人骨靶向干扰素γ(rhIFNγ-D10)进行体外骨靶向性和促进巨噬细胞向破骨细胞分化的活性分析。方法采用羟基磷灰石体外结合实验分析钙亲和力,表征目的蛋白靶向骨组织能力。分别测定重组人骨靶向干扰素γ(rhIFNγ-D10)和非骨靶向性重组人干扰素γ(rhIFNγ)体外结合羟基磷灰石的能力并加以比较,分析天冬氨酸寡肽对干扰素γ骨靶向性的影响。用RANKL、RANKL+rhIFNγ-D10、RANKL+rhIFNγ、rhIFNγ-D10和rhIFNγ分别诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法评价rhIFNγ-D10对破骨细胞分化形成的影响。结果rhIFNγ-D10体外结合羟基磷灰石的能力明显高于rhIFNγ,说明天冬氨酸寡肽有助于将干扰素γ靶向骨组织。与RANKL对照组相比,RANKL+rhIFNγ-D10组和RANKL+rhIFNγ组破骨细胞分化染色细胞明显减少,说明在RANKL诱导破骨细胞分化条件下,rhIFNγ-D10和rhIFNγ对破骨细胞分化有抑制作用。结论采用大肠杆菌表达的rhIFNγ-D10具有骨靶向性,但未显示预期的促进小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的作用,相反表现出一定的抑制作用,其分子机制有待进一步研究。

π-π堆叠和化学交联共同作用的聚合物胶束的构建及表征

目的合成能实现π-π堆叠和化学交联共同作用的两亲性嵌段共聚物PEG-b-P(TMC-COOH)-b-P(CL-Bz),提高胶束在血液循环中的稳定性以及药物在胶束中的滞留。方法通过含有苄基侧链的碳酸酯单体(TMC-Bz)构建了PEG-b-P(TMC-Bz)嵌段。然后,通过PEG-b-P(TMC-Bz)末端羟基引发使含有苯环侧链的己内酯单体(CL-Bz)开环聚合,生成PEG-b-P(TMC-Bz)-b-P(CL-Bz)。最后,在Pd/C作用下脱去P(TMC-Bz)中的苄基,构建出PEG-b-P(TMC-COOH)-b-P(CL-Bz)。对合成的单体及聚合物进行核磁共振氢谱(^(1)H NMR)及凝胶渗透色谱(GPC)表征。另外,通过动态光散射(DLS)对基于该聚合物制备的(交联)空胶束及载药胶束进行表征,并通过GPC对交联反应时间以及交联剂用量对交联度的影响进行了探索。结果成功合成了PEG-b-P(TMC-COOH)-b-P(CL-Bz)聚合物。用该聚合物制备的交联聚合物胶束粒径较小(~80 nm)且均一,而且对紫杉醇的包封率可以达到90%以上。基于聚合物中活化的羧基和交联剂胱胺二盐酸盐中的氨基的交联反应在12 h之内结束,且交联程度随着交联剂用量的增大而增大。结论成功构建了能实现π-π堆叠和化学交联共同作用的PEG-b-P(TMC-COOH)-b-P(CL-Bz)聚合物胶束给药系统。