LncRNA H19和HIF-1α及与其相关的miRNAs在稽留流产胎盘绒毛组织中表达模式的研究

目的 分析稽留流产患者胎盘绒毛组织中长链非编码RNA(lncRNA)H19与低氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达模式。方法 收集2013年1月至2014年12月石家庄第六医院送检的稽留流产患者胎盘绒毛组织纳入患者组(48例),并以1∶1的比例匹配收集同期正常人工流产孕妇的胎盘绒毛组织纳入对照组(48例);又依据年龄不同将每组分为4个亚组:<26岁组、26~<31岁组、31~<36岁组、≥36岁组。利用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)定量分析lncRNA H19与HIF-1α在胎盘绒毛组织中的表达变化,并分析两者是否存在调控关系;利用RNAInter、ENCORI数据库预测与lncRNA H19和HIF-1α存在互作关系的microRNAs(miRNAs),并利用qRT-PCR方法定量分析miRNAs在胎盘绒毛组织中的表达变化,综合分析lncRNA H19与HIF-1α和miRNAs间是否存在调控关系。结果 qRT-PCR检测发现,与对照组相比,稽留流产患者组胎盘绒毛组织中H19 mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05);但与同年龄段对照组比较,患者组胎盘绒毛组织中H19 mRNA的相对表达量在<26岁时显著降低(P<0.05),在≥36岁时显著升高(P<0.05)。与对照组相比,患者组胎盘绒毛组织中HIF-1α mRNA相对表达量显著上调(P<0.01);与同年龄段对照组比较,除了31~<36岁组外,患者组<26岁组、26~<31岁组和≥36岁组HIF-1α mRNA的相对表达量均显著上调(P<0.05)。利用RNAInter、ENCORI数据库进行基因互作预测及参考之前文献,miR-675-5p、miR-21-5p、miR-18a-5p、miR-301a-3p、miR-454-3p、miR-93-5p与lncRNA H19和HIF-1α均存在互作位点;qRT-PCR检测这些miRNAs的相对表达量,结果显示与对照组相比,除了miR-18a的相对表达量在两组间无显著性差异(P>0.05),miR-675、miR-21、miR-301a、miR-454、miR-93在稽留流产患者组胎盘绒毛组织中的表达量均显著上调(P<0.05)。与同年龄段对照组比较,稽留流产患者组中miR-454在<26岁时显著上调(P<0.01),miR-301a在<26岁与≥36岁时显著上调(P<0.05),而miR-21在<26岁、26~<31岁、31~<36岁、≥36岁时均显著上调(P<0.05)。结论 LncRNA H19和HIF-1α、miR-21、miR-301a、miR-454在稽留流产患者不同年龄组的胎盘绒毛组织中均存在显著的表达差异,提示其可能与稽留流产的发生有关。

吡虫啉对大鼠卵巢颗粒细胞孕酮合成的影响

目的探究新烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMI)对大鼠卵巢颗粒细胞孕酮合成的影响。方法使用不同浓度(0、100、200、500、1000μmol/L)的IMI分别处理大鼠卵巢颗粒细胞48 h,收集细胞及细胞培养液上清,电化学发光法检测孕酮和雌二醇(E_(2))水平;Western Blot法检测IMI处理后颗粒细胞孕酮合成关键酶甾体激素合成急性调节蛋白(StAR)的相对表达量;使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002与1000μmol/L IMI共处理颗粒细胞48 h后,收集细胞培养液上清检测孕酮水平。结果IMI处理大鼠卵巢颗粒细胞48 h,与对照组相比,随着IMI浓度的增加,细胞培养上清液中孕酮水平呈剂量依赖性增加(P<0.05),E_(2)水平无显著变化(P>0.05);Western Blot结果显示,与对照组相比,不同浓度的IMI处理颗粒细胞48 h后,StAR蛋白的相对表达量均显著升高(P<0.01)。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002与1000μmol/L的IMI共处理颗粒细胞48 h后,与对照组相比,LY294002显著降低颗粒细胞基础孕酮的合成水平(P<0.01);与IMI共处理能显著抑制IMI刺激孕酮合成的效果(P<0.001)。结论IMI影响大鼠卵巢颗粒细胞孕酮的合成,其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

五氯硝基苯影响大鼠卵泡发育的机制研究

目的探究有机氯农药五氯硝基苯(PCNB)影响大鼠卵泡发育的分子机制。方法将14只青春前期SD雌性大鼠随机分为对照组和实验组,每组各7只。实验组给予PCNB(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),对照组给予等体积玉米油,连续灌胃7 d。取卵巢组织HE染色,观察并统计各级卵泡数目;通过RNA-Seq测序筛选差异表达基因,随后进行GO富集和KEGG功能注释分析;Western Blot检测大鼠卵巢AKT的磷酸化水平和张力蛋白同源物(PTEN)的表达。结果与对照组相比,实验组原始卵泡显著减少(P<0.05),生长卵泡显著增加(P<0.05)。测序结果共筛选出261个差异表达的基因(|log2 Fold change|>1,q<0.05),与对照组相比,实验组上调的基因有62个,下调的基因有199个;GO分析显示差异表达基因主要富集在细胞分化、细胞内信号转导、ATP结合的微管装配等;KEGG富集分析提示PI3K-AKT信号通路富集的差异基因数目较多;Western Blot结果显示,与对照组相比,实验组AKT磷酸化水平显著增加(P<0.05);PTEN表达量显著减少(P<0.05)。结论PCNB加速大鼠原始卵泡发育与卵巢PI3K-AKT信号通路激活相关。

苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠卵巢功能的影响

苯醚甲环唑应用广泛,在食用农产品中存在残留超标现象,并在不孕女性人群血清和卵泡液中有检出。为探究苯醚甲环唑亚急性经口暴露后对卵巢功能的影响,本研究采用酶联免疫分析方法,测定了分别灌胃给予50、100和200 mg/(kg bw·d)剂量的苯醚甲环唑玉米油溶液后,大鼠血清中孕酮(P)和雌二醇(E2)含量的变化,并在对大鼠卵巢进行苏木精-伊红(HE)染色后,通过光学显微镜观察统计了各级卵泡的数量。结果表明:苯醚甲环唑各剂量暴露组及对照组大鼠卵巢脏器系数均无显著性差异。200 mg/(kg bw·d)高剂量暴露组大鼠血清孕酮水平显著高于对照组(P<0.01),50和100 mg/(kg bw·d)剂量暴露组则与对照组无显著性差异,但均显著低于高剂量暴露组(P<0.05);各剂量暴露组及对照组之间血清雌二醇水平均无显著性差异。从卵泡的发育情况看,200 mg/(kg bw·d)高剂量暴露组生长卵泡的占比显著高于对照组(P<0.05),50和100 mg/(kg bw·d)剂量暴露组则与对照组无显著性差异。研究表明,200 mg/(kg bw·d)剂量的苯醚甲环唑亚急性经口暴露会对大鼠卵巢产生一定的毒性影响,该暴露剂量下可导致大鼠血清孕酮水平和生长卵泡比例升高。

新烟碱类杀虫剂吡虫啉对大鼠卵巢功能的影响

目的 探讨新烟碱类杀虫剂吡虫啉(IMI)对大鼠卵巢功能的影响。方法 将30只21日龄的雌性SD大鼠随机分为3组,每组10只,根据IMI暴露的浓度分为低浓度组(19 mg·kg^(-1)·d^(-1))和高浓度组(38 mg·kg^(-1)·d^(-1)),对照组则给予同等体积的生理盐水。连续灌胃30 d,对动物状态进行记录;采用电化学发光法测定大鼠血清中孕酮和雌二醇(E_(2))的含量,Western Blot法检测大鼠卵巢中胆固醇侧链裂解酶(P_(4)50scc)和芳香化酶(Aromatase)的表达量,行卵巢组织切片苏木精-伊红(HE)染色以观察卵泡形态、统计各级卵泡数量,同时进行抗苗勒管激素(AMH)免疫组化染色观察其表达量的变化。结果 各组大鼠灌胃期间毛发、进食情况、活动情况均无明显异常。随IMI暴露剂量增加,大鼠血清孕酮和E_(2)水平也逐渐增加;与对照组相比,低浓度组和高浓度组孕酮水平略增高,但均无显著性差异(P>0.05);与对照组相比,高浓度组血清中E_(2)水平显著升高(P<0.05)。Western Blot结果显示,IMI暴露后大鼠卵巢组织中P_(4)50scc和Aromatase表达量随IMI浓度增加而升高,与对照组相比,低浓度组中P_(4)50scc和Aromatase的表达量虽有增加但无显著性差异(P>0.05),高浓度组中P_(4)50scc和Aromatase的表达量显著增加(P<0.01)。卵泡计数结果显示,与对照组相比,低浓度组和高浓度组大鼠卵巢中总卵泡数均显著减少(P<0.001);与对照组相比,高浓度组原始卵泡比例显著降低(P<0.001),低浓度组生长卵泡比例显著增加(P<0.05)。免疫组化染色结果显示,与对照组相比,低浓度组和高浓度组的AMH表达均下降,IMI高浓度组AMH下降更明显。结论 IMI暴露后会导致大鼠卵巢甾体激素的生成增加,并改变卵泡发育的进程。

低氧诱导因子-3α对胎盘滋养层细胞生长的影响

目的研究低氧诱导因子-3α(HIF-3α)对人绒毛膜滋养层细胞(HTR8/SVneo)生物学行为的影响。方法构建人HIF-3α过表达载体(pcDNA3.1-HIF-3α),并筛选HIF-3α抑制剂(HIF-3αsiRNA)最佳靶序列;用2.5μg的pcDNA3.1-HIF-3α质粒和75 pmol/L的HIF-3αsiRNA分别转染HTR8/SVneo细胞作为转染组,同时各自设立阴性转染组。采用EdU法和MTT法检测细胞增殖和细胞活力水平;用细胞流式法检测细胞凋亡水平;并用细胞培养小室(Transwell)法检测细胞浸润和迁移的能力。结果蛋白质印迹法(Western Blot)结果表明成功构建了过表达载体pcDNA3.1-HIF-3α,并筛选到HIF-3αsiRNA#2是最佳抑制靶序列(P<0.05)。EdU实验结果显示,过表达HIF-3α使细胞的增殖显著增强(P<0.05),敲低HIF-3α则使细胞的增殖显著下降(P<0.05)。MTT法检测发现,过表达HIF-3α后细胞活力无显著差异(P>0.05);敲低HIF-3α后细胞活力显著升高(P<0.05)。细胞流式法检测发现,HIF-3α过表达有降低HTR8/SVneo细胞早期凋亡的趋势,但无显著差异(P>0.05);HIF-3α敲低后细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。Transwell小室法检测发现,HIF-3α过表达使细胞的迁移以及浸润显著增强(P<0.05),而HIF-3α敲低后细胞的迁移以及浸润显著下降(P<0.05)。结论HIF-3α是调节HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和浸润能力的重要因子。

早期胚胎停育绒毛滋养层细胞病理学变化

目的观察早期胚胎停育(MA)胎盘绒毛滋养层细胞的病理学变化。方法选择2011年12月至2013年12月于河北石家庄第六医院门诊就诊的260例MA患者(孕周<12周)作为研究对象(MA组),选择该院自愿行人工流产的正常早孕孕妇(孕周<12周)作为对照组,共396例。取MA组及对照组患者的胎盘绒毛组织送至北京龙迈达科技公司制成组织阵列芯片,样本按≤25岁、26~30岁、31~34岁、≥35岁年龄区间分组,每组随机挑选10对(病例及对照)进行分析。采用免疫组化法检测反映胎盘血管发生的血管内皮生长因子(VEGF)、反映滋养层细胞和间质细胞分布情况的细胞角蛋白(CK19)和波形蛋白(Vimentin)在MA组和对照组患者早孕绒毛滋养层细胞中的表达差异;通过Tunel法检测MA组和对照组患者早孕绒毛滋养层细胞的凋亡情况。结果早期MA组绒毛滋养层细胞中VEGF表达量较对照组显著降低(P<0.01),而MA组绒毛滋养层细胞中CK19及Vimentin表达与对照组无统计学差异(P>0.05));MA组绒毛滋养层细胞的凋亡指数显著高于对照组(P<0.001)。结论胎盘绒毛滋养层细胞中VEGF的低表达及细胞凋亡指数的增加与胚胎停育发生密切相关,提示胎盘血管生成减少和滋养层细胞过度凋亡是造成早期胚胎停育的部分原因。

miR-143在卵泡刺激素介导的卵巢颗粒细胞孕酮生成中的作用

目的 探讨miR-143在卵泡刺激素(FSH)介导的卵巢颗粒细胞孕酮生成中的作用。方法 实时定量RT-PCR检测FSH诱导原代颗粒细胞后miR-143的表达;重组腺病毒感染颗粒细胞进行miR-143的过表达;放射免疫法(RIA)测定孕酮的水平。结果 50ng/ml的FSH处理原代颗粒细胞24h后颗粒细胞分泌孕酮显著增加(P<0.001),建立了FSH刺激原代颗粒细胞分泌孕酮模型。miR-143在FSH处理颗粒细胞6、12h后表达没有显著变化,在24h后表达显著增加(P<0.01),在48h时表达量最高(P<0.001)。与感染对照病毒Ad-miRNC组相比,感染Ad-miR143组的细胞miR-143表达水平显著增加(P<0.01)。感染Ad-miR143后颗粒细胞与空白对照组和感染对照病毒组相比,孕酮分泌水平显著升高(P<0.01)。结论 miR-143可以促进FSH介导的卵巢颗粒细胞孕酮生成。

小鼠卵巢不同发育时期SDF-1/CXCR4轴的动态变化

目的分析基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体(CXCR4)在不同发育时期雌性ICR小鼠卵巢组织中的表达及意义。方法选择4周龄、7周龄和10周龄雌性ICR小鼠共30只,根据典型发育时期分为3组:性成熟前期(4周龄)组、性成熟期(7周龄)组及适龄繁殖期(10周龄)组,每组各10只。每组取5只收集卵巢组织,一侧卵巢提取RNA后利用qPCR检测SDF-1和CXCR4 mRNA表达水平;一侧卵巢固定包埋后切片,采用HE染色观察卵巢组织形态并进行各级卵泡计数,采用免疫组化方法观察SDF-1及CXCR4蛋白在小鼠卵巢组织的表达。余下每组5只促排卵后获取卵丘卵母细胞复合物(COCs),分离卵丘颗粒细胞与卵母细胞并提取RNA,利用qPCR分别检测两种细胞中SDF-1和CXCR4的mRNA表达水平。结果3组小鼠中性成熟前期组卵巢SDF-1 mRNA表达量显著高于其他两组(P<0.05),而CXCR4 mRNA表达量显著低于其他两组(P<0.01)。HE染色显示3个发育阶段小鼠卵巢均可见发育正常的各级卵泡;适龄繁殖期组的卵巢总卵泡数目及初级卵泡数量显著高于其余两组(P<0.01),次级卵泡数显著多于性成熟期组(P<0.01)。免疫组化结果表明:SDF-1及CXCR4蛋白在卵巢各级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中都有表达,而在卵泡膜细胞中几乎不表达。COCs的qPCR结果显示:卵母细胞中,性成熟期组SDF-1 mRNA表达水平显著高于性成熟前期组(P<0.05);卵丘颗粒细胞中,适龄繁殖期组SDF-1 mRNA表达水平显著高于其余两组(P<0.01),性成熟前期组CXCR4 mRNA表达水平显著低于其余两组(P<0.05)。结论SDF-1及其受体CXCR4在不同发育阶段小鼠卵巢卵泡中均有表达且表达水平存在显著差异,提示其可能参与调控小鼠卵泡发育和性腺成熟的过程。

溴氰菊酯对大鼠卵巢甾体激素合成的影响

目的探讨溴氰菊酯(Deltamethrin,DLT)对大鼠卵巢甾体激素合成的影响及相关的分子机制。方法不同剂量DLT暴露处理大鼠和原代颗粒细胞;取DLT暴露后的大鼠血清和培养上清液,电化学发光法测定雌二醇和孕酮的水平;Western Blot法检测DLT暴露后大鼠卵巢组织及原代培养颗粒细胞中甾体激素合成关键酶:甾体激素合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、芳香化酶的表达量,同时检测组蛋白去乙酰化酶Sirt1的蛋白表达。结果体、内外实验中,DLT各处理组大鼠血清、原代颗粒细胞培养上清液中雌二醇水平均显著升高(体内实验P<0.05,体外实验P<0.001);体内实验中DLT各处理组大鼠血清孕酮水平均显著降低(P<0.05),而体外实验中DLT各处理组原代颗粒细胞培养上清液孕酮水平无显著变化(P>0.05);体、内外实验中DLT各处理组大鼠卵巢组织、原代培养颗粒细胞中StAR、P450scc、芳香化酶以及Sirt1的表达量均显著升高(P<0.01)。结论 DLT能影响大鼠卵巢雌二醇和孕酮的合成,其机制可能与其关键酶表达的变化有关。

五氯硝基苯亚急性暴露对卵巢甾体激素合成的影响

目的探究五氯硝基苯(PCNB)亚急性暴露对SD大鼠卵巢甾体激素合成的影响。方法将30只3周龄雌性SD大鼠随机分为3组:给予50 mg·kg^(-1)·d^(-1)PCNB灌胃给药的为低剂量组,给予100 mg·kg^(-1)·d^(-1)PCNB灌胃给药的为高剂量组,给与等体积玉米油灌胃给药的为对照组,每组10只,连续灌胃28 d。用电化学发光法检测各组大鼠血清孕酮和E2水平;用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠卵巢组织中3种甾体激素合成关键酶:类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)及芳香化酶(Aromatase)的表达情况。结果PCNB亚急性暴露期间,两实验组大鼠的体重变化、卵巢系数与对照组比较均无显著差异(P>0.05);两实验组大鼠血清孕酮水平均显著高于对照组,血清E2水平均显著低于对照组(P<0.05)。Western Blot结果显示,大鼠卵巢组织中StAR的表达量低剂量组>高剂量组>对照组,各组组间无统计学差异(P>0.05);大鼠卵巢组织中P450scc表达量高剂量组>对照组>低剂量组,各组组间无显著性差异(P>0.05);低、高剂量组大鼠卵巢组织中芳香化酶表达水平均显著低于对照组(P<0.05),并呈剂量依赖性下降。结论PCNB亚急性暴露可导致大鼠血清孕酮和E2水平发生改变,其机制可能与卵巢组织中甾体激素合成关键酶的表达量改变有关。

外源性全氟丁基磺酸钾暴露对小鼠植入前胚胎发育的影响

目的通过全氟丁基磺酸钾(PFBSK)急性暴露建立早期胚胎损伤模型,探讨PFBSK是否具有胚胎毒性及可能损伤的机制。方法本实验动物选取雄性10~12周龄和雌性6~8周龄的ICR小鼠,利用体外受精技术获取受精卵,并在含有PFBSK 0 mol/L(对照组)、10^(-3)mol/L、10^(-4)mol/L、10^(-5)mol/L及10^(-6)mol/L的培养基中培养受精卵,使其经历受精卵时期(1-细胞时期)、2-细胞时期、≥4-细胞时期、桑椹胚时期与囊胚时期,观察PFBSK是否对各个时期的胚胎发育率造成影响;并利用活性氧检测试剂盒和凋亡检测试剂盒分析是否存在由PFBSK引起的氧化应激损伤及细胞凋亡。结果与对照组相比,PFBSK 10^(-4)mol/L组、PFBSK 10^(-5)mol/L组和PFBSK 10^(-6)mol/L组的2-细胞率、≥4-细胞率、桑椹胚率及囊胚率均无显著性差异(P>0.05),并且胚胎发育形态良好,未见异常;而PFBSK 10^(-3)mol/L组的囊胚率与对照组相比显著下降(P<0.05),且部分胚胎停滞于桑椹胚,延长发育时期也无法使其生长至囊胚。PFBSK 10^(-3)mol/L组囊胚细胞活性氧水平显著高于对照组(P<0.05),但PFBSK 10^(-3)mol/L组的囊胚细胞凋亡平均荧光强度与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论PFBSK可能存在潜在的胚胎毒性,会造成早期胚胎氧化应激损伤,但并非会走向主动凋亡的结局。