2017年江苏省重要寄生虫病防控技术培训效果分析

目的评估2017年江苏省重要寄生虫病防控技术培训对于提升基层专业技术人员寄生虫病防控意识及检测水平的效果。方法采用理论授课和实践操作相结合的方式对从事寄生虫病防治的基层专业技术人员进行培训,培训结束后分别对学员进行理论和镜检技能考核。结果共有13个市132名学员参加了培训,无学员缺考。总成绩平均分为118.36分,苏北、苏中和苏南地区学员总考核成绩间差异有统计学意义(χ2=13.38,P<0.01),苏北地区学员成绩显著高于苏中(P<0.001)和苏南地区(P=0.016)。理论考核平均分为79.05分,及格率为92.4%;苏北、苏中、苏南地区学员理论考核成绩间差异有统计学意义(χ2=14.51,P<0.01),苏北地区学员成绩显著高于苏中(P<0.001)和苏南地区(P=0.009)。镜检考核平均分为39.32分,及格率为89.4%;苏北、苏中、苏南地区学员镜检考核成绩间差异无统计学意义(F=2.37,P=0.09)。7种寄生虫虫卵检出率间差异有统计学意义(χ2=31.23,P<0.01);其中卫氏并殖吸虫卵检出率最高,为75%;血吸虫和布氏姜片吸虫虫卵检出率较低,分别为51.5%和54.5%;鞭虫、未受精蛔虫、华支睾吸虫和带绦虫虫卵检出率分别为71.2%、65.9%、72.7%、72.0%。结论专业技术培训提升了江苏省基层专业技术人员对于重要寄生虫病的防控意识及病原学检测水平,为下一步开展重点寄生虫病防控工作提供了技术保障。

江苏省血吸虫病查病质控体系的构建与应用Ⅱ县级人员病原学检测能力评估

目的评价江苏省县级血防机构开展血吸虫病病原学检测水平,提高专业技术人员血吸虫病病原学检测能力,为构建血吸虫病现场查病质控体系提供技术支撑。方法人工获取家兔血吸虫肝卵,制备成4个不同浓度的虫卵悬液,采用单盲法开展虫卵孵化检测,比较县级工作员检测结果与标准结果的符合率、误检率和漏检率。结果江苏省28个县(市、区)共检测虫卵悬液560份,检出阳性283份,阴性203份,总符合率为86.79%,总误检率为9.38%,总漏检率为15.77%,检测结果与标准结果差异有统计学意义(χ~2=12.99,P<0.01)。28个县(市、区)中有20个县(市、区)出现了漏检,占71.43%;13个县(市、区)出现了误检,占46.43%。江滩、山丘、水网和湖滩4类地区病原学检测误检率为4.55%~43.75%,差异有统计学意义(χ~2=30.34,P<0.01);漏检率为4.17%~20.45%,差异无统计学意义(χ~2=5.09,P=0.17)。传播控制和传播阻断2类流行区病原学检测误检与漏检率分别为7.50%、13.33%与10.42%、17.13%,差异无统计学意义(χ~2=0.229、0.575,P均>0.05)。达到血吸虫病传播控制10年及以上和不足10年地区误检与漏检率分别为11.81%、5.00%与16.67%、14.17%,差异无统计学意义(χ~2=2.804、2.848,P均>0.05)。达到血吸虫病传播阻断10年及以上与不足10年地区误检率分别为11.54%与10.00%,差异无统计学意义(χ~2=0.069,P=0.792);漏检率分别为10.90%与35.00%,差异有统计学意义(χ~2=17.364,P<0.01)。结论江苏省县级水平血吸虫病查病工作存在漏检、误检现象,现场病原学检测能力有待进一步提高。

等温扩增技术在寄生虫及其他病原体检测中的应用

以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)为基础的体外核酸扩增技术已成功应用于科学研究各方面。近年来等温扩增技术(Isothermal amplification technology)凭借恒温、高效、耗时短、不过分依赖设备仪器等优点越来越多地被应用于分子诊断及疾病检测中。本文对现有的部分等温扩增技术原理、特点以及在寄生虫病病原体及其他病原体检测方面的应用进行综述,并展望其应用前景。

青蒿琥酯对日本血吸虫诱导的早期肝纤维化小鼠热休克蛋白47表达影响的研究

目的研究青蒿琥酯对日本血吸虫诱导的早期肝纤维化小鼠血清和肝组织中热休克蛋白47(HSP47)表达的影响,探讨青蒿琥酯抑制日本血吸虫病肝纤维化作用的可能机制。方法 30只ICR小鼠随机分成感染模型组、感染治疗组和健康对照组等3组,每组10只。感染组每鼠经腹部皮肤贴壁感染日本血吸虫尾蚴(20±1)条,健康对照组不感染。感染后第6周,用吡喹酮300 mg/kg 2日疗法杀虫,同时感染治疗组小鼠按60 mg/kg剂量每天腹腔注射0.3 ml青蒿琥酯,连续2周;感染模型组和健康对照组腹腔注射灭菌生理盐水0.3 ml。治疗结束次日,各组小鼠用戊巴比妥钠麻醉后采血,应用ELISA检测血清HSP47和转化生长因子β1 (TGF-β1)含量,取小鼠肝、脾称重,计算脏器指数。取部分肝组织,应用碱水解法检测肝羟脯氨酸含量。取部分肝组织,用10%多聚甲醛固定,行苏木素-伊红(HE)和Masson染色,观察肝组织病理学变化和胶原增生情况。取部分肝组织,应用实时荧光定量PCR检测肝脏HSP47 mRNA、Ⅰ型胶原α1链mRNA表达水平。结果健康对照组小鼠肝脏指数为(4.72±0.52),低于感染模型组(10.50±0.57)和感染治疗组(8.31±0.52)(P <0.01),感染治疗组小鼠肝脏系数与感染模型组差异有统计学意义(P <0.01);健康对照组小鼠脾脏系数为(0.38±0.04),低于感染模型组(2.41±0.44)和感染治疗组(2.26±0.06)(P <0.01),感染治疗组小鼠脾脏系数与感染模型组差异无统计学意义(P> 0.05)。HE染色结果显示,感染治疗组小鼠肝脏肿大程度和表面虫卵结节较感染模型对照组轻、小。Masson染色结果显示,感染治疗组小鼠肝脏肉芽肿大小和胶原纤维面积均较感染模型组小,感染模型组胶原增生面积为(25.78±2.61)%,高于感染治疗组的(6.87±3.54)%和健康对照组的(1.19±0.18)%(P <0.01)。ELISA检测结果显示,感染治疗组小鼠血清HSP47、 TGF-β1含量分别为(169.81±20.94) pg/ml、(20.82±1.90) ng/ml,均低于感染模型组[(203.14±46.29) pg/ml、(27.49±6.81) ng/ml](P <0.05),二者HSP47、TGF-β1含量均高于健康对照组(P <0.01)。羟脯氨酸含量和肝组织HSP47 mRNA、Ⅰ型胶原α1链mRNA表达量与血清HSP47、 TGF-β1含量的趋势一致:感染治疗组小鼠肝羟脯氨酸含量为(0.27±0.08) mg/g肝湿重,低于感染模型组的(0.69±0.07) mg/g肝湿重(P <0.01),二者肝羟脯氨酸含量均高于健康对照组[(0.11±0.04) mg/g肝湿重](P <0.05);感染治疗组小鼠肝脏HSP47 mRNA、Ⅰ型胶原α1链mRNA表达水平分别为(0.49±0.27)、(0.67±0.09),均低于感染模型组的(0.84±0.17)、(0.91±0.11)(P <0.05),二者HSP47 mRNA、Ⅰ型胶原α1链mRNA表达水平均高于健康对照组(0.24±0.04、 0.24±0.05)(P <0.01)。血清HSP47水平与TGF-β1水平呈正相关关系(r=0.928 0);血清HSP47水平、 TGF-β1水平与肝组织Ⅰ型胶原α1链mRNA表达水平间均呈正相关关系(r=0.926 2、 0.872 8)。结论青蒿琥酯对日本血吸虫诱导的小鼠早期肝纤维化具有较好的干预效果,其机制可能系通过下调HSP47的表达水平抑制胶原合成,进而减轻肝纤维化程度。

重组酶介导核酸等温扩增荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的研究

目的探索重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)荧光法用于日本血吸虫感染性钉螺早期检测的可行性。方法用日本血吸虫毛蚴人工感染200只湖北钉螺,随机分为阳性对照组和实验组各100只,另取100只未感染钉螺作为阴性对照组。将阳性对照组钉螺饲养至70 d,通过逸蚴法观察感染情况并计算阳性率。实验组钉螺分别在3 h以及5、20、40、70 d随机取20只,压碎镜检,同时提取钉螺软体DNA,进行荧光RAA法检测,获得不同时间点的阳性率,并与阳性对照组相比较。通过二代测序法对RAA检测阳性的特异性扩增产物进行测序鉴定。结果毛蚴感染后3 h、5 d、20 d、40 d、70 d实验组钉螺RAA法检测阳性率分别为60%、60%、65%、60%、70%,压碎镜检的阳性率分别为0、0、0、15%、65%,除70 d外其余时间点两种检测方法的阳性率差异均有统计学(χ^2=17.14,χ^2=17.14,χ^220 d=19.26,χ^2=8.64,均P<0.01);各时间点间阳性率差异无统计学意义(χ^2=0.68,P>0.05),各时间点阳性率与阳性对照组阳性率64.6%比较差异均无统计学意义。RAA扩增产物经二代测序后与数据库比对,确认为血吸虫特异性基因片段。结论 RAA荧光法敏感、特异,可用于日本血吸虫感染性钉螺的早期检测。

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA)。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。

中华按蚊细胞色素P450基因表达特征分析

目的探讨6种溴氰菊酯抗性候选细胞色素P450(CYP)基因(CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16)在中华按蚊体内的表达特征。方法收集中华按蚊不同发育时期(卵、幼虫、蛹、雌性成蚊和雄性成蚊)和组织(唾液腺、马氏管、中肠、卵巢以及脂肪体)样本,以及雌性成蚊在暴露于不同溴氰菊酯剂量(0、1.25、3.75、6.25、12.5μg/瓶)和时间(0,5、15、30、60 min)后的样本.提取总RNA,利用反转录实时定量PCR(q PCR)技术分析CYP6M3、CYP6Y1、CYP6P5、CYP4H14、CYP4G17、CYP12F16基因在中华按蚊不同发育时期、组织以及不同溴氰菊酯接触剂量和时间下的相对表达量。结果 CYP6M3与CYP6Y1基因在雄性中华按蚊成蚊体内的表达量最高,CYP6M3基因在雄性成蚊体内的表达量是雌性成蚊的35.1倍,CYP6Y1基因在雄性成蚊体内的表达量是雌性成蚊的61.4倍;CYP4H14基因在幼虫期表达量最低,且在雌性成蚊体内表达量是四龄幼虫体内表达量的22.5倍。候选CYP基因在中华按蚊不同组织内的表达量差异具有统计学意义,CYP6M3基因在马氏管内的表达量是在卵巢中的38.9倍,CYP6Y1基因在脂肪体内的表达量是在卵巢中的9.1倍,CYP6P5基因在中肠内的表达量是在卵巢中的30.3倍,CYP4G17基因在脂肪体内的表达量是在卵巢中的4.6倍,CYP12F16基因在马氏管内的表达量是在卵巢中的4.4倍。接触不同溴氰菊酯剂量和时间对候选CYP基因的表达水平表现出一定的诱导效应,影响候选CYP基因在中华按蚊体内的表达。结论候选CYP基因在不同发育期中华按蚊体内和不同组织中差异表达,暴露于不同溴氰菊酯剂量和时间影响CYP基因在中华按蚊体内表达。