N-乙酰半胱氨酸抑制亚砷酸钠诱导心肌细胞凋亡和自噬作用的研究

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制亚砷酸钠诱导H9C2细胞凋亡和自噬作用及机制。方法:用亚砷酸钠诱导H9C2细胞构建凋亡和自噬模型。采用CCK-8比色法检测细胞的存活率,Hoechst 33258核染色法观察凋亡细胞的形态和数量改变.双氯荧光素染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western Blot法测定蛋白P53、Bcl-2、Bax及LC3的表达水平,以及磷酸化ERK1/2蛋白及ERK1/2蛋白总量的表达水平。结果:与对照组相比,15μM亚砷酸钠处理的H9C2细胞存活率显著降低.细胞内ROS水平明显增加.凋亡细胞数量明显增多,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值明显增大(P<0.01)。1 mM NAC预处理后显著减少H9C2细胞内ROS的生成和促凋亡蛋白P53和Bax的表达,诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高,同时降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值。亚砷酸钠处理诱导ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),而NAC和亚砷酸钠共处理抑制了ERK1/2蛋白的磷酸化。结论:亚砷酸钠降低H9C2细胞的存活率,增加细胞内ROS的生成,诱导细胞凋亡和自噬。NAC通过降低H9C2细胞内的ROS水平和抑制ERK1/2蛋白的磷酸化拮抗亚砷酸钠诱导的细胞凋亡和自噬。

MiR-30d在稽留流产胎盘绒毛组织中表达的研究

目的通过研究miR-30d在人稽留流产胎盘绒毛组织中的表达模式,探讨miR-30d与稽留流产的关系。方法收集2013年1月至2014年12月于石家庄第六医院治疗的稽留流产患者及同期该院1∶1匹配的正常人工流产孕妇为研究对象,分别为稽留流产组(80例)和对照组(80例);将稽留流产组按照年龄不同分为4个亚组:年龄≤25岁组(Y≤25)、26～30岁组(Y 26～30)、31～35岁组(Y 31～35)、≥36岁组(Y≥36)。收集各组绒毛组织,利用qRT-PCR技术和原位杂交技术检测miR-30d在胎盘绒毛组织中的表达及定位。结果两组比较发现miR-30d在稽留流产组绒毛组织中的表达有上调趋势,但尚无显著性差异(P>0.05)。与对照组比较,miR-30d在Y≤25组患者胎盘绒毛组织中表达显著下调(P<0.01),在Y26～30组患者胎盘绒毛组织中表达极显著降低(P<0.01),在Y 31～35组患者胎盘绒毛组织中表达上调(P<0.05),在Y≥36组患者胎盘绒毛组织中表达没有显著变化(P>0.05)。进一步分析发现在Y≤25组中,70%稽留流产患者胎盘绒毛组织中miR-30d表达显著下调(P<0.01);在Y 26～30组,100%稽留流产患者胎盘绒毛组织中miR-30d表达显著下调(P<0.01);而在Y 31～35组和Y≥36组,miR-30d的表达没有明显规律。原位杂交结果显示miR-30d表达主要定位于胎盘绒毛合体滋养层细胞。结论对于小于30岁的稽留流产患者,miR-30d在胎盘合体滋养层中表达下调,可能是引起稽留流产的原因之一。

亚砷酸钠对胚胎p66Shc表达调控的机制研究

目的探究亚砷酸钠对胚胎p66Shc表达调控的分子机制。方法利用5μmol/L亚砷酸钠处理HEK293ET细胞,收集细胞样品,利用实时定量PCR(Q-PCR)检测p66Shc转录水平,Western Blot检测Sirt1的蛋白表达;利用Sirt1siRNA和对照siRNA分别转染细胞,随后5μmol/L亚砷酸钠处理细胞,收集细胞样品,Western Blot检测亚砷酸钠对Sirt1和p66Shc蛋白表达的影响。结果与对照组相比,5μmol/L亚砷酸钠处理组p66Shc转录水平显著升高(P<0.001),Sirt1蛋白水平显著降低(P<0.001)。Sirt1siRNA转染能够抑制细胞Sirt1的表达。亚砷酸钠处理后,Sirt1siRNA转染组Sirt1的表达与对照siRNA转染组相比显著降低(P<0.001),p66Shc的表达显著升高(P<0.001)。结论亚砷酸钠可能通过抑制Sirt1的表达上调p66Shc的表达。

叶酸对阿霉素诱导心脏毒性的拮抗作用研究

目的:探究叶酸对阿霉素(DOX)诱导心脏毒性的拮抗作用。方法:利用DOX(40μmol/L)与叶酸(75μmol/L)处理6hpf斑马鱼胚胎,72hpf时观察胚胎心包水肿情况,计录胚胎15s内心率,荧光显微镜下观察心脏结构,固兰染色观察心脏血细胞分布和量。利用DOX(5μmol/L)与叶酸(75μmol/L)共处理心肌细胞,免疫印迹试验检测切割后的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)的水平。结果:DOX处理后胚胎表现出心包水肿、心率降低、心脏结构异常。叶酸与DOX共处理后胚胎心包水肿率降低至17%,低于DOX单处理组(P=0.0097)(n=25);心率恢复至37±1.6次/15s,高于DOX单处理组(P<0.001)(n=10);叶酸抑制DOX引起的心脏结构异常,并且使固兰染色异常率降低至22.4%,低于DOX单处理组(P=0.0098)(n=35)。叶酸抑制DOX诱导的心肌细胞切割后的Caspase3水平升高。结论:叶酸对DOX诱导的心脏毒性具有一定的拮抗作用,其作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡相关。

CRISPR/Cas9技术及其在非编码RNA编辑中的应用

基因的定点修饰是研究基因功能的重要手段之一,而基因定点修饰技术的发展也经历了从早期的基因打靶到三代人工核酸内切酶的过程。第三代人工核酸内切酶规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRTSPR/Cas)因其操作简便、成本低廉、作用高效,被迅速应用于生物学研究的各个领域。非编码RNA(ncRNAs)不具编码蛋白功能,直接以RNA的形式参与机体的几乎所有生理、病理过程。本文对CRISPR/Cas9技术的结构、发展和应用进行综述,并着重介绍其在miRNA和lncRNA编辑中的应用。

化疗药物致卵巢损伤的表型分析及可能机制

目的探索化疗药物对小鼠卵巢的影响及可能的机制。方法将60只ICR小鼠平均分为给药组和对照组。给药组小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺120mg/kg+白消安20mg/kg,对照组小鼠注射同等体积的DMSO;通过观察小鼠动情周期的变化、性激素水平、卵巢组织形态及卵泡计数分析化疗药物对卵巢的影响;通过检测抗苗勒管激素(AMH)、Ki67表达水平等分析卵巢储备能力和细胞增殖能力的变化。结果给药组雌激素水平(203.00±24.91pmol/L)比对照组(379.00±36.13pmol/L)显著降低(P<0.01);给药组脏器系数(0.0318)比对照组(0.0487)显著下降(P<0.01);给药组可见卵巢萎缩、各级卵泡数目明显减少、卵泡闭锁增多;给药组颗粒细胞分泌的AMH明显减少、增殖细胞数目显著降低(P<0.01)。结论化疗药物能导致小鼠卵巢损伤,卵巢储备能力和卵巢细胞的增殖能力明显下降。

利用CRISPR/Cas9技术对miRNA-125a进行基因编辑的实验研究

近年来, CRISPR/Cas9技术被迅速应用于生物学研究的各个领域。miRNA-125a已被证实与生殖密切相关,研究者在自然流产的患者中发现了异常的miRNA-125a。该研究利用CRISPR/Cas9技术在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中对miRNA-125a进行了定点编辑。对于定点敲除,我们首先在pX458表达载体的基础上额外引入一组启动子和sgRNA骨架序列用于片段敲除,此后分别设计用于单点敲除和片段敲除的sgRNA进行表达载体的构建,表达载体转染HTR8细胞后通过流式分选和T7EI酶切鉴定阳性单克隆;对于定点敲入,我们在体外构建供体载体,与CRISPR表达载体共转染HTR8细胞,通过流式分选和PCR鉴定阳性单克隆。DNA测序结果显示,敲除及敲入阳性单克隆细胞系在指定区域的碱基序列发生了改变; RT-qPCR结果显示,阳性单克隆细胞系中mi RNA-125a-5p和mi RNA-125a-3p的表达量较野生型也发生了相应变化;体外实验还显示, miRNA-125a有抑制HTR8-S/Vneo细胞系增殖及迁移的功能。研究证实, CRISPR/Cas9技术在细胞系中编辑mi RNAs是有效可行的,且对于miRNA-125a的定点敲除,片段敲除的效果要好于单点敲除。

MiR-483在人稽留流产胎盘绒毛组织中表达模式

目的研究人不同年龄阶段稽留流产(MA)胎盘绒毛组织中miR-483的表达模式,分析其与稽留流产的关系。方法通过把研究对象按照1∶1匹配的方法,将2013年1月至2014年12月期间在石家庄市第六医院进行治疗的稽留流产患者以及同期正常人工流产孕妇进行分组,即为稽留流产组(80例)和对照组(80例);依据年龄差异,将两个组别进一步分为4个亚组,依次为:年龄≤25岁组、26～30岁组、31～35岁组、≥36岁组,分别利用qRT-PCR方法和原位杂交定量和定性分析miR-483在人稽留流产胎盘绒毛组织中的表达与定位。结果 qRT-PCR检测发现与对照组相比,在≤25岁组和26～30岁组MA患者胎盘绒毛组织中miR-483的表达量均显著下调(P均<0.01),在31～35岁组MA患者绒毛组织中miR-483的表达量显著增加(P<0.05),在≥36岁组MA患者绒毛组织中没有明显变化。进行个体化分析发现,在≤25岁组中,100%MA患者miR-483表达显著降低(P均<0.01);在26～30岁组,80%MA患者miR-483表达显著下调(P均<0.05);而在31～35岁组和≥36岁组,miR-483的表达没有明显规律。原位杂交检测显示miR-483表达与胎盘绒毛合体滋养层和间质细胞。结论 miR-483在小于30岁人稽留流产患者胎盘组织中表达下调,提示其可能与稽留流产发生相关。

p66^(Shc)对亚砷酸钠诱导心肌细胞氧化应激的影响

目的探讨p66^(Shc)在亚砷酸钠介导的心肌细胞氧化应激中的作用。方法利用亚砷酸钠诱导的H9C2心肌细胞氧化应激模型,分别用CCK-8比色法检测细胞活力;双氯荧光素探针检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测p66^(Shc)、磷酸化p66^(Shc)的表达变化;免疫荧光共聚焦检测p66^(Shc)的亚细胞定位。结果与对照组相比,5μM亚砷酸钠处理组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞内ROS水平显著升高(P<0.001);砷引起了p66^(Shc)表达量增加,而且磷酸化p66^(Shc)与p66^(Shc)蛋白总量的比值也显著升高(P<0.05),p66^(Shc)在砷刺激下从细胞浆向线粒体转位。过表达野生型p66^(Shc)质粒增加砷介导的心肌细胞内ROS水平,而过表达突变型p66^(Shc)质粒和敲低p66^(Shc)的表达都降低砷处理组细胞内ROS水平。结论研究显示亚砷酸钠可能通过上调p66^(Shc)的表达和磷酸化水平诱导心肌细胞ROS水平的升高。

蓬乱蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

目的:探讨蓬乱蛋白2(Dvl2)对血管紧张素II诱导心肌细胞肥大的影响。方法:用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理心肌细胞48h,Western Blot检测Dvl2的表达。用重组腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分别感染大鼠原代心肌细胞24h后用Ang II处理48h,利用免疫荧光技术检测心肌细胞面积,免疫印迹实验检测心肌肥大标志物-MHC和相关信号通路。结果:AngⅡ处理引起Dvl2表达增加;与对照组相比,Ad-Dvl2感染显著增强了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大和-MHC表达增加,而Dvl2过表达引起蛋白激酶B(AKT)磷酸化的增加。结论:Dvl2能促进AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与激活AKT信号通路相关。

大鼠子宫宫腔粘连模型的建立及评价指标

子宫内膜损伤是导致宫腔粘连的最主要原因,建立有效的子宫内膜损伤动物模型是研究此类疾病发生、发展和治疗反应等不可或缺的支撑条件。通过宫腔注射95%的乙醇制造大鼠(Rattus norvegicus)子宫内膜损伤模型,检测胚胎植入数目来分析子宫内膜损伤对大鼠生育情况的影响,观察大鼠子宫内膜厚度、腺体数量和纤维化面积,分析乙醇处理对子宫内膜的影响;检测细胞角蛋白(CK-19)和波性蛋白(Vimentin)的表达水平,分析上皮细胞和间质细胞的增殖分化及子宫内膜损伤程度。结果显示,正常组大鼠子宫比损伤组更为平滑且有韧性,与正常组相比,损伤组大鼠生育率显著降低(P<0.01),子宫内膜厚度变薄(P<0.01)、腺体数量显著减少(P<0.01),纤维化面积显著增大(P<0.01),CK-19和Vimentin表达量显著下调。结果提示已成功建立大鼠子宫内膜损伤动物模型。