血管内皮生长因子与色素上皮衍生因子在糖尿病猕猴视网膜病变早变早期的表达

目的检测糖尿病视网膜病变早期猕猴视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)的表达,探讨其意义。方法通过空腹血糖值糖化血红蛋白水平、眼底彩照情况及糖尿病病程,确定入选3只利用高脂饲料诱导成功且处于糖尿病视网膜病变早期的猕猴及3只年龄相当的健康猕猴。行实时荧光定量PCR及免疫组织化学检测,观察猕猴视网膜内VEGF和PEDF表达情况。结果处于糖尿病视网膜病变早期的猕猴视网膜内VEGF在mRNA表达水平(P<0.05)及蛋白表达水平(P<0.05)均明显高于对照组猕猴,糖尿病组猕猴视网膜内PEDF mRNA表达量相比对照组显著减少(P<0.01),PEDF蛋白表达与其mRNA表达趋势一致(P<0.05)。结论猕猴糖尿病视网膜早期,出现VEGF的上调和PEDF的下调,对糖尿病视网膜病变的发生具有一定的提示意义,可为早期糖尿病视网膜病变提供辅助诊断。

Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Th1/Th2型细胞因子表达分析

检测Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Ⅰ型辅助T细胞(Th1)因子IL-2和IFN-γ以及Ⅱ型辅助T细胞(Th2)因子IL-4、IL-10的表达及分布变化情况,研究Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病发病中的变化。取Ⅱ型糖尿病及健康猕猴胰腺、肝、肾和心脏,通过石蜡切片、常规染色观察病理变化,同时采用免疫组织化学SABC法检测各靶器官IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达及分布情况。病理结果显示:糖尿病猕猴肝血窦增宽伴中性粒细胞浸润,肾、心脏和胰腺细胞呈不同程度肿胀、萎缩及坏死。免疫组织化学结果显示:在肾中Th1型细胞因子IFN-γ表达水平高于健康组(P<0.01)并分布于近曲小管、远曲小管及集合管。胰腺中IFN-γ表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P>0.05),阳性产物分布于胰岛部及外分泌部。胰腺及肾中Th1型细胞因子IL-2表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺及肾中Th2型细胞因子IL-4表达水平显著低于健康组(P<0.01),阳性产物分布于远曲小管、胰腺胰岛及外分泌部。在胰腺、肾、肝及心脏中,Th2型细胞因子IL-10表达水平显著高于健康组(P<0.01),阳性产物分布于近曲小管、远曲小管、胰腺胰岛、胰腺外分泌部、心肌细胞及肝细胞的胞质中。Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)的发病过程中发生了显著变化。

雌激素受体在老年和青年猕猴下丘脑中表达的比较

为了观察老年猕猴下丘脑中雌激素受体的表达及变化情况,运用免疫组织化学SABC法,对青年和老年猕猴下丘脑雌激素受体的表达特点进行了研究。结果发现,雌激素受体免疫阳性细胞主要分布于下丘脑的室周灰质、室旁核、腹外侧核、腹内侧核、弓状核等,雌激素受体阳性产物主要定位于细胞核和细胞质中。与青年猕猴比较,老年猕猴下丘脑各个核团的雌激素受体在表达强度及阳性细胞数量上均显著或极显著低于青年猕猴(P<0.05或P<0.01)。表明,老年猕猴下丘脑雌激素受体的表达显著低于青年猕猴,可能为老年猕猴雌激素缺乏所致。

猕猴脾脏中雌激素受体的表达及其性别差异

选取健康成年雌雄猕猴各3只,采用免疫组织化学SP法研究了雌激素受体(ER)在脾脏中的分布,观察猕猴脾脏中ER的表达及性别差异。结果显示,ER免疫阳性反应物主要分布于脾脏红髓区,脾小结相对较少,而动脉周围淋巴鞘、血管内皮、脾小梁等组织结构内仅有少量分布。ER阳性产物主要定位于细胞核中,部分存在于胞浆和胞膜上。雌性猕猴脾脏中的阳性细胞数量显著高于雄性,表达强度也较雄性强。这表明,ER参与雌激素对脾脏的免疫功能调控。ER阳性产物分布特点表明雌激素发挥作用主要是通过经典基因组机制,同时也通过非基因组机制途径。而ER表达的明显性别差异提示体内雌激素水平可能对脾脏中B淋巴细胞的功能有正调节作用。

肺炎链球菌感染的猕猴肺及气管内IFN-γ蛋白与mRNA表达

采用常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosim,HE)染色、免疫组织化学和组织原位杂交技术,观察感染肺炎链球菌的猕猴肺及气管组织的病理学变化与γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)在其中的蛋白与mRNA表达.结果表明:在光镜下感染组的肺呈现大面积充血、出血,淋巴细胞浸润及肺泡腔内出现浆液性渗出物;IFN-γ蛋白表达面积均高于健康组(P<0.05);IFN-γ蛋白产物在肺血管内的光密度值极显著高于健康组(P<0.01),在气管和肺的其他部位光密度值显著高于健康组(P<0.05);IFN-γmRNA在肺气管上皮层、肌层内阳性产物的光密度值均极显著高于健康组(P<0.01),肺泡隔、血管内、气管固有层内阳性产物的光密度值均显著高于健康组(P<0.05).说明肺炎链球菌感染的猕猴肺出现了明显的红色肝变期病理变化,且肺及气管中IFN-γ蛋白及mRNA表达显著增加,表明IFN-γ在肺炎链球菌感染猕猴肺及气管的免疫调节中起到了重要作用.

感染肺炎链球菌猕猴消化系统白细胞介素6的表达观察

检测猕猴自发性感染肺炎链球菌后,白细胞介素6在胃肠道以及肝脏、食管的表达变化,探讨肺炎链球菌的发病机制以及自发性肺炎链球菌性肺炎的病理特点。采用常规H.E.染色观察消化系统病理组织学变化,采用免疫组织化学和原位杂交方法检测白细胞介素6在肝脏、食管、空肠、盲肠和胃组织的表达变化。各组织表现出典型的炎症病变,肝组织和肠腺均可见大面积坏死,在空肠、盲肠和肝脏中有明显的广泛性出血和充血现象;肠道有大量炎性细胞浸润。和健康组比较,白细胞介素6在感染组的胃肠道以及肝脏、食管中的表达均呈现升高趋势,感染组的IL-6阳性细胞总面积比正常组有显著性升高(P<0.05)。在胃肠道以及食管的表达主要集中在粘膜层,在肝脏相对集中分布于血管周围。阳性细胞包括了部分腺体细胞、肝细胞、内皮细胞、未角化上皮细胞以及淋巴细胞。白细胞介素6作为一种炎症细胞因子在肺炎链球菌感染中发挥了一定的作用,可能参与了肺炎的病理过程并对机体清除肺炎链球菌有一定促进作用。

感染肺炎链球菌的猕猴消化系统分泌型免疫球蛋白A的表达

采用免疫组织化学和原位杂交方法检测分泌型免疫球蛋白A(SIgA)在自发性感染肺炎链球菌的猕猴胃肠道以及肝脏、食管的表达变化,通过测定光密度值和表达面积比较感染前后的分泌变化,探讨SIgA在肺炎链球菌发病机制中的作用以及自发性肺炎链球菌性肺炎的病理特点.免疫组化结果显示,和健康组比较,SIgA在感染组的光密度值以及表达面积在各组织中均有下降趋势,其中在空肠阳性细胞的表达面积下降显著(P<0.05);原位杂交结果和免疫组化结果基本一致,感染组各组织阳性细胞表达面积均较健康组减少,其中空肠、盲肠以及胃组织差异显著(P<0.05),感染组光密度值较健康组高,但差异均不显著(P>0.05).阳性细胞的分布多集中于各胃肠段和食管的黏膜层,血管中可见较多阳性细胞,而肝脏中的阳性细胞多呈散在分布.其中,阳性细胞主要包括胃肠道黏膜层的淋巴细胞和肝细胞、血管内细胞以及炎性浸润细胞,部分腺体细胞、上皮细胞和食管黏膜层未角化上皮细胞也有阳性反应.上述结果表明,SIgA可通过以体液免疫为主的免疫机制帮助机体清除肺炎链球菌;SIgA作为黏膜免疫系统中重要的抗体分子在感染组组织中表达水平的降低可能是导致肺炎链球菌入侵机体从而引起感染的一个因素.

大豆异黄酮对大鼠肠道上皮内淋巴细胞、杯状细胞及瘦素长型受体的影响

大豆异黄酮具有广泛的生理作用,其对免疫系统的影响近年来成为一个焦点。为了研究大豆异黄酮对肠黏膜屏障结构的重要组成部分(上皮内淋巴细胞、杯状细胞)及免疫调节因子瘦素受体(长型)的影响,本实验采用高脂饲料喂饲大鼠,建立肥胖模型;然后将筛选出的肥胖大鼠分别灌胃剂量为对照(I:0mg/kg)、低(Ⅱ:50mg/kg)、中(Ⅲ:150mg/kg)、高剂量(Ⅳ:450mg/kg)的大豆异黄酮,并设置基础对照组(Ⅴ:溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),连续4周用HE、PAS染色观察小肠上皮内淋巴细胞、杯状细胞数量和分布变化;用免疫组织化学SABC法测定瘦素受体(长型)水平。结果表明:大鼠上皮内淋巴细胞以小型淋巴细胞为主,主要分布于上皮的基底膜附近;大鼠杯状细胞分布在肠黏膜上皮层;瘦素受体(长型)阳性细胞分布于黏膜层。应用大豆异黄酮高剂量组较对照组大鼠的肠黏膜上皮内淋巴细胞数量和杯状细胞的数量明显增加,且有向肠内层移动趋势,同时肠黏膜瘦素受体(长型)水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。表明大豆异黄酮在一定程度上可促进大鼠小肠黏膜屏障结构趋于完整并提高其免疫功能。

MPTP诱导慢性帕金森病恒河猴模型的初步建立

拟建立一种不仅操作简便而且能较好模拟帕金森病(Parkinsons disease,PD)临床症状和病理进程的造模方法。选取健康老龄雌性恒河猴12只,随机分为实验组9只(进而按临床症状及行为学评分又分为3个亚组)和对照组3只,以0.2mg/(kg·d)小剂量、多次重复肌内注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)来建立慢性PD恒河猴动物模型,对照组注射同等剂量的0.9%氯化钠溶液。每日于MPTP给药前后观察记录各组动物行为学表现各30min。实验结束后,全部处死动物,采用免疫组织化学法检测黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的分布与表达变化对模型进行验证。行为学结果显示,实验组动物出现3种不同程度的临床表现,根据其轻重,将其分为3个亚组;TH免疫组织化学结果显示,阳性物质主要分布于神经元胞质和突起内,与对照组相比,实验组中的第1、第2、第3亚组阳性总面积分别减少71.90%,61.90%,45.74%,差异有统计学意义(P<0.01);α-syn免疫组织化学结果显示,阳性物质主要分布于神经突起内,其次为细胞间质,并在濒临死亡动物的黑质致密部检测到路易小体,实验各组动物黑质阳性总面积较对照组分别增加170.29%,137.82%,47.88%,差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果表明,采用小剂量、多次重复肌内注射MPTP方式能够建立老龄恒河猴PD动物模型,该模型能够较好地模拟PD病人的临床症状和病理进程,是研究PD病因、发病机制、药物治疗及基因治疗较可靠的实验动物模型。

庆大霉素致大鼠肾毒性模型中早期生物标志物的表达

通过研究肾毒性早期生物标志物肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)在庆大霉素诱导的大鼠肾毒性模型中的表达,探讨其在氨基糖苷类药物安全性评价中的应用价值.将45只SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组、庆大霉素低剂量组(50 mg/kg)和庆大霉素高剂量组(100 mg/kg),每组15只,连续肌内注射7 d,对照组给予等体积0.9%氯化钠注射液.给药第1、3和7天分别处死各组5只大鼠,腹主动脉采血检测血清肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平,肾组织HE染色观察病理改变,实时荧光定量PCR法和免疫组织化学检测KIM-1和NGAL的表达.结果表明,血清肌酐和尿素氮水平仅在给药第7天明显升高;病理组织学观察发现,肾损伤严重程度随时间及剂量依赖性增加,高剂量组给药7 d后近端小管刷状缘消失,上皮细胞脱落坏死,出现蛋白管型及间质炎性细胞浸润.KIM-1和NGAL的mRNA及蛋白表达水平均在给药第1天就显著上调(P<0.05),之后呈时间-剂量依赖性升高,与病理组织学改变过程相一致,且优先于临床生化检测指标.支持这2个生物标志物作为庆大霉素引起的急性肾损伤的敏感指标.

猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的克隆及原核表达

为了研究动物溶组织内阿米巴基因工程疫苗,以川西猕猴溶组织内阿米巴分离株中提取的总基因组DNA为模板,扩增了hgl基因抗原区LC3段,将其重组于原核表达载体pET-32b(+)中,构建了pET-32b(+)-hglLC3表达载体,转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达融合蛋白,获得了1200bp的hgl基因LC3编码区片段;SDS-PAGE分析结果显示,重组表达质粒产生了大小为66ku的目的条带,与预期的结果一致;Western-blot分析结果显示,重组蛋白与兔超免疫血清呈阳性反应,表明,该抗原可作为动物溶组织内阿米巴疫苗的候选抗原。

T1DM猕猴肝中CB1R和GR及FAAH的表达

通过研究1型糖尿病(T1DM)猕猴肝内大麻素1型受体(CB1R)、脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和糖皮质激素受体(GR)蛋白和mRNA表达量的变化,探讨内源性大麻素系统对糖尿病猕猴肝的影响。苏木精-伊红染色观察糖尿病猕猴肝的病理变化,均可见肝细胞肿胀伴气球样变,不同程度脂肪变性。油红O染色结果显示,糖尿病猕猴组猕猴肝中脂滴含量显著高于对照组(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,糖尿病组猕猴肝中CB1R表达量高于对照组(P<0.05),而糖尿病组猕猴肝中FAAH、GR表达量均低于对照组(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,CB1R、GR、FAAH的mRNA的表达量变化与蛋白表达一致,对照组与糖尿病组差异相比有高度统计学意义(P<0.01)。结果表明,CB1R、GR、FAAH与T1DM猕猴肝病理损伤密切相关,可为临床上该疾病的监测与治疗提供依据。