应用荧光微球技术进行免疫检测研究

以聚苯乙烯羧基荧光微球为固相载体,将人免疫球蛋白G(IgG)和猪血红蛋白(Hb)分别与微球偶联,应用Luminex-100TM荧光微球检测系统检测抗体IgG和抗原Hb与荧光微球的偶联效率。结果表明,采用100μg.mL-1抗体或抗原浓度可以获得较高的偶联效率,且检测快速灵敏。应用荧光微球进行抗原抗体免疫检测可行。

基于金磁微粒标记技术的可目视化蛋白质芯片检测方法的建立

目的应用金磁微粒标记蛋白质技术,建立可目视化蛋白质芯片检测体系,比较金磁微粒和胶体金标记蛋白质技术应用于蛋白质芯片检测效果的优劣。方法将人IgG点制于环氧基修饰的玻片上,分别与金磁微粒和胶体金标记的羊抗人IgG温育,银染显色,肉眼观察并用普通扫描仪记录结果。结果基于金磁微粒的蛋白质芯片人IgG最佳点样浓度为0.2mg/ml,37℃温育2h,银染10～15min,检测结果信噪比高;基于胶体金的蛋白质芯片人IgG最佳点样浓度为0.1mg/ml,37℃温育1h,银染15～20min,检测结果信噪比高。结论金磁微粒标记蛋白质技术应用于蛋白质芯片的检测,具有和胶体金一致的可目视化检测效果,且其标记技术简单,标记的蛋白质可定量。

利用金磁微粒免疫化学发光技术检测高敏C反应蛋白

目的建立灵敏、准确的高敏C反应蛋白（hsCRP）检测方法。方法以金磁微粒为载体，辣根过氧化物酶．鲁米诺．双氧水为化学发光体系，建立hsCRP的检测方法。对方法的线性、灵敏度、精密度、准确性等进行评估。对233例临床样本进行检测，与德国西门子散射比浊法检测结果进行比对。结果该方法在（0．15～25．00）mg／L范围内呈现优良线性（R^2=0．9937），最低检测限为0．076mg／L，批内精密度〈10．00％、批间精密度〈15．00％，平均回收率为97．80％。与德国西门子散射比浊法相比，具有相关性、一致性良好的特点。结论利用金磁微粒免疫化学发光技术可成功检测hsCRP。

凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用

建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法,对实验条件进行了优化,应用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成.将凝集素ConA、GNA固定于环氧化修饰的玻片表面,用Cy3标记标准糖蛋白RNaseB,利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法.摸索出最佳封闭剂是含1%BSA的磷酸缓冲液,最佳孵育时间及温度为3h和室温,最佳孵育缓冲液为含1%BSA和0.05%Tween-20的磷酸缓冲液,并用甘露糖抑制实验验证了凝集素芯片结合的特异性.用包含10种凝集素的芯片,成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖链构成,证实了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性.最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成,发现Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价Sia或GlcNAc、terminalα-1,3 mannose、GalNAc、Galβ-1,4GlcNAc这些糖链结构的存在.蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动中起着重要作用,因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视,但由于缺乏一种简便、快速、高通量的检测手段,蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢.凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测分析.

激光捕获显微切割联合基因芯片在肿瘤差异表达基因研究中的应用

目的 为激光捕获显微切割(LCM)联合基因芯片在肿瘤差异表达基因研究中应用摸索可行的技术方法.方法 采用LCM 技术分别自原发性膀胱移行癌患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织冻存标本获取细胞,提取RNA,用Agilent 2100 Bioanalyzer 芯片分析系统进行RNA完整度(RIN)检测.取总RNA 100 ng 进行线性扩增和荧光标记,获得aRNA 探针.取等量的癌组织探针与癌旁正常组织探针,与Agilent 人全基因组寡核苷酸基因表达谱芯片杂交.通过自身比较实验分析芯片的假阳性基因数,计算假阳性率(FPR).通过数据分析寻找癌组织与癌旁正常组织差异表达基因.结果 LCM 所获微量RNA 的RIN 都在8.0 以上,表明LCM 后RNA 完整度较高.100 ng RNA 经过线性扩增与荧光标记,获aRNA 产量约16 μg,片段大小0.5 ～ 2.5 kb.芯片自身比较实验结果良好,FPR ＜ 1%,验证了实验系统的可靠性.相对于癌旁正常组织,癌组织发生表达上调的基因有286 条,下调的基因112 条.结论 以LCM 技术获得的细胞提取RNA 用于制备基因芯片探针,获得了可信的芯片杂交结果,为肿瘤基因差异表达研究提供了可行的技术方法.

葡聚糖磁性复合微粒的辐照灭菌研究

为满足葡聚糖磁性复合微粒临床无菌应用要求,采用60Coγ射线对该微粒进行辐照灭菌处理,考察吸收剂量为9 kGy、15 kGy和25 kGy时对其物理化学性质的影响,并对灭菌微粒进行无菌检查及方法验证。结果表明:该磁性复合微粒在3种吸收剂量下均表现出良好的稳定性,其物理化学性质均未出现明显变化;经辐照灭菌的微粒达到10-1的无菌保证水平,已建立的无菌检查方法可靠。

非还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程中集聚现象的研究

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效凝胶排阻色谱法,研究了非还原脲变性蛋白溶菌酶在稀释复性过程中的集聚现象.实验发现,在整个稀释复性过程中,没有蛋白溶菌酶集聚体沉淀产生.当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度小于4.0mg/mL时,复性过程中不会形成蛋白溶菌酶分子集聚体;当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度介于4.0～8.0mg/mL时,复性过程中会形成由非共价相互作用所引起的蛋白溶菌酶二分子和三分子集聚体;而当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度大于8.0mg/mL时,复性过程中除了会形成二分子和三分子蛋白溶菌酶集聚体外,还会形成四分子蛋白溶菌酶集聚体.在此基础上,结合文献,对非还原脲变性蛋白溶菌酶的稀释复性过程进行了描述.

金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究

以Sepharose CL-6B为载体,环氧氯丙烷为活化剂,羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)为螯合配基制备载有Co2+的金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose,并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。对纯化200μL细胞裂解液中靶蛋白所需Co-CM-Asp-Sepharose介质用量,Co-CM-Asp-Sepharose与细胞裂解液的孵育时间,介质清洗条件及靶蛋白洗脱时所需咪唑浓度等进行了优化。比较了Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose(Qiagen公司)两种螯合介质对融合蛋白的纯化效果,开展了从5mL细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究,并通过Bradford法测定了Co-CM-Asp-Sepharose对CD155D1蛋白的纯化量。结果表明:对200μL细胞裂解液纯化体系,Co-CM-Asp-Sepharose(50%悬浮液)的优选体积为60μL,最佳孵育时间为30min,洗脱液最佳咪唑浓度为200mmol/L,纯化得到融合蛋白的量约为200μg。介质用量放大为1.5mL(50%悬浮液)对CD155D1蛋白的纯化量可达4.6mg。与商品化Ni-NTA-Agarose相比,本介质具有选择性好,清洗条件简单,得到的靶蛋白纯度高等优点。

功能化磁性微粒的合成及表面巯基的测定

目的研究以3-巯丙基三乙氧基硅烷作为Fe3O4磁性粒子表面修饰剂,合成微米级磁响应性好且巯基含量较高的功能化磁性微粒,并对磁性微粒粒径以及表面巯基含量进行表征。方法激光粒度散射仪对功能化磁性微粒进行粒径分析,傅立叶变换红外光谱(FTIR)对巯基修饰前、后磁性微粒表面的功能基团进行表征,E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量进行定量测定。结果氮气保护,乙醇与水体积比1∶1作为溶剂,500μL浓氨水为催化剂,加入300μL硅烷化试剂与170 mg磁性Fe3O4粒子充分反应,合成了平均粒径约为5μm的巯基化磁性微粒,所建立E llman方法对功能化磁性微粒表面巯基含量的测定结果为357μmol/g。结论功能化磁性微粒表面巯基的修饰及定量测定,为其在生物及医学领域的应用奠定了基础。

人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的应用研究

目的:采用人乳头瘤病毒(HPV)液态芯片对HPV感染患者进行基因分型,为早期诊断与治疗HPV感染和宫颈癌提供依据。方法:采用13种HPV基因分型液态芯片,对100例尖锐湿疣及100例宫颈糜烂患者进行HPV基因分型检测。以反向斑点印迹法作为对照检测。结果:100例尖锐湿疣患者中感染HPV单一型占78%(其中HPV6占42%,HPV11占36%);混合型占20%,其中高危型占6.3%。宫颈糜烂患者临床标本PCR阳性率为55%;对50例PCR阳性的患者进行HPV分型,其中9例可检出型别,高危型占67%。两种方法检测有较高的一致性,但液态芯片方法更灵敏。结论:HPV基因分型液态芯片可以快速、精确和高通量地对HPV感染标本进行HPV分型检测。

酸酶序解法制备高吸水性玉米多孔淀粉的研究

以玉米淀粉为原料,采用酸酶序解法制备了高吸水性玉米多孔淀粉。通过单因素实验和正交实验研究了酸酶序解过程中各主要因素对多孔淀粉吸水性能的影响。确定最佳酸处理条件为:盐酸质量浓度3.0%、淀粉乳质量浓度40%、处理时间70 min、处理温度50℃;最佳酶解条件为:复合酶加量为理论水解量的40%、酶解时间18 h、酶解温度40℃、pH值4.0。用该酸酶序解法制备的玉米多孔淀粉的吸水率为156.98%,比传统的单用复合酶解法提高约20%。

应用Real Time PCR方法检测病毒灭活去除效率

目的建立检测血液制品中病毒灭活去除效率的模型。方法应用SYBR GREEN I实时荧光定量PCR验证不同方法的病毒去除效率,并用病毒感染力实验验证不同方法的病毒灭活效率。结果以PCR产物为外参的实时荧光定量PCR正确反映出实际核酸含量和检出拷贝数的线性关系,以重组质粒为外参的实时荧光定量PCR实验证明巴氏灭毒法的病毒去除效率低于金磁颗粒法。病毒感染力实验证明巴氏灭毒法灭活效率略高于金磁颗粒法。结论实时荧光定量PCR法联合病毒感染力试验可以有效评价不同方法在病毒灭活和病毒去除方面的差异。

金磁微粒介导的盐酸克伦特罗多克隆抗体的纯化

以重氮化法制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白(CBL-BSA)抗原并免疫家兔制备多克隆抗体,将表面固定有BSA的金磁微粒(金磁微粒-BSA)与多克隆抗体反应,抗BSA抗体通过抗原抗体反应被吸附在金磁微粒表面,磁性分离,利用ELISA法对纯化前后抗CBL及抗BSA抗体的效价进行测定,确定最佳纯化条件,得到高纯度的抗CBL抗体。结果表明,通过一步反应．可实现载体蛋白BSA在金磁微粒表面的固定化,每毫克金磁微粒固定 BSA的容量可达236 μg;在最佳纯化条件(温度4C,反应时间2h,金磁微粒表面BSA质量与抗体质量比为7:1) 下,金磁微粒-BSA可有效地去除偶联物多克隆抗体中的抗BSA抗体,而纯化前后抗CBL抗体的效价基本保持不变,分离纯化效果较好。该方法可方便、快速地去除多克隆抗体中的无关抗体,对小分子半抗原多克隆抗体的纯化具有重要意义。

应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

目的应用液态悬浮芯片技术,建立一种新的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法。方法应用通用引物从HPV基因组中扩增出目的片断,与13型荧光微球偶联探针杂交,通过LuminexTM100检测HPV的型别。结果检测十三型标准株质粒,对单一标准品和混合标准品均可准确分型。结论初步建立了高通量、快速、可靠、适用于临床的人乳头瘤病毒分型基因诊断方法。

生物组织微阵列芯片自动制备仪的研制

介绍了一种新型生物组织微阵列芯片自动制备仪的研制。分析了组织微阵列制备过程中的操作任务和实现目标,进行了制备仪的结构设计和各功能模块研究开发。制备仪从结构上分为蜡块承载定位模块和三工位操作模块,控制系统的组成有操作空间精密定位子系统,组织蜡块图像识别子系统,蜡块打孔填埋作业子系统等。研制成功的制备仪样机具备了图像自动识别、精密定位、自动打孔填埋等功能,实现了生物组织微阵列芯片的自动化制备。

COMT基因多态性与儿童精神发育迟滞及儿童认知能力的相关性研究(英文)

儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)是儿茶酚胺类神经递质的主要代谢酶。COMT是儿茶酚-O-甲基转移酶的编码基因,其第4外显子的一个G/A转换可产生不同活性的等位基因。许多遗传学研究报道,这种功能多态性与人类精神类疾病相关。文章利用PCR扩增技术和限制性片段长度多态(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)方法,研究中国秦巴山区精神发育迟滞(MentalRetardation,MR)儿童与正常对照儿童的COMT基因功能多态情况,探讨COMT基因功能多态性与儿童认知能力水平的相关性。病例-对照分析结果显示,COMT基因的不同活性等位基因型与秦巴山区儿童MR无相关性(χ2=0.776,P>0.05),其等位基因频率与儿童MR也未呈现出相关性(χ2=0.335,P>0.05)。但是,在研究中还发现,该地区智商分(IQ)不小于55分的儿童群体中,COMT基因的多态性分布与儿童的智力呈现出相关的趋势。在智力正常组儿童中(IQ≥85),COMT高活性等位基因纯合体(COMTHH)频率及其等位基因(COMTH)频率较高,分别为60.98%、79.28%。在智力边缘组儿童(70≤IQ<85)中,其频率分别为46.67%、70.67%,相应地也低于正常组的频率(0.10>P>0.05)。结果提示,在中国秦巴山区人群中,COMT基因的功能多态性与儿童MR的形成无明显相关性,但它对正常儿童的认知能力可能有一定影响。

秦巴山区汉族人群DXS8027基因座的多态性分布研究

为了解秦巴山区汉族人群的DXS8027微卫星序列的遗传多态性,获得该基因位点的群体遗传学数据。采集秦巴山区汉族人群无关个体静脉血样550份,EDTA抗凝,用酚—氯仿法抽提基因组DNA,PCR扩增目的片段,8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,0.1%硝酸银(AgNO3)染色分型。结果,在秦巴山区人群中共检出9种不同的DXS8027等位基因,整体人群的基因频率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),并具有较高的杂合度(Het=0.7968)。虽然男性和女性间等位基因分布不一致(χ2=30.242,P<0.01),但在不同地域同性别人群间、不同地域的全体研究人群间无差异(χ2=4.703,P>0.05;χ2=14.952,P>0.05;χ2=15.2,P>0.05);比较秦巴山区和欧洲人群的DXS8027等位基因,发现两者之间存在极显著差异(χ2=37.572,P<0.01)。这些结果为进一步研究该位点在不同人群中的分布提供了基础数据。

载阿霉素磁性壳聚糖微球靶向治疗大鼠移植性肝癌

目的合成磁性壳聚糖微球并将其应用于Walker-256大鼠移植性肝癌模型治疗研究。方法将荷瘤大鼠分3组:生理盐水组、阿霉素组及载阿霉素磁性壳聚糖微球组,门静脉给药;对各组动物进行生存率分析以及给药前后白细胞和血小板计数分析。结果载药磁性壳聚糖加磁场治疗组较生理盐水和阿霉素治疗组生存期明显延长(P<0.05),并可以部分抑制阿霉素对骨髓干细胞的损伤作用。结论靶向治疗明显减轻了阿霉素的骨髓抑制毒性,显著延长了荷瘤大鼠的寿命。

猪血红蛋白及戊二醛聚合猪血红蛋白氧载体的研究

目的阐明猪血红蛋白的主要理化特性,并了解戊二醛聚合反应对猪血红蛋白主要性能的影响。方法猪血经多步纯化获取高纯度猪血红蛋白,以戊二醛为交联剂制备聚合猪血红蛋白样品。鉴定猪血红蛋白的纯度、聚合体分子量分布、携氧性能及自氧化等指标。结果猪血红蛋白在生理pH条件下的P50为23.6 mmHg,Hill系数为2.86。聚合猪血红蛋白为分子量大小不均一的混合体,聚合体P50和Hill系数均减小,自氧化趋势增大。结论猪血红蛋白具有较高氧亲和力,与人血红蛋白相似,明显高于牛血红蛋白。猪血红蛋白的丰富来源、特殊的氧亲和力和较好的化学稳定性等特点使其可成为一种血红蛋白类氧载体产品制备的有用材料。

微型流动注射化学发光仪测定蔬菜中残留的有机磷农药

目的利用便携式流动注射化学发光仪和紫外降解装置,检测蔬菜中残留的有机磷农药。方法过硫酸钾在紫外光的催化下能将有机磷降解为无机磷,无机磷在酸性条件下可以和钒酸盐、钼酸盐反应生成具有氧化性的磷钼钒杂多酸,可直接氧化鲁米诺产生强而稳定的化学发光信号;根据发光强度与磷的浓度在一定范围内呈线性关系,从而实现有机磷农药的定量测定。结果测定磷的检出限为1.0×10^-10g/mL,线性范围为1.0×10^-9-3.0×10^-6g/mL,对浓度为2.0×10^-7g/mL的磷平行测定11次,相对标准偏差为2.1%;当青菜中有机磷农药的添加浓度为1.00 mg/kg和2.00 mg/kg时,方法回收率在89.5%-113.5%之间。结论此方法简便快捷、准确可靠,实现了检测仪器的自动化和微型化,为市售蔬菜中有机磷农药残留的现场检测奠定了基础。