富脂微环境通过PPARγ/ABCG2途径促进三阴性乳腺癌细胞的多药耐药

目的:探讨富脂微环境(ARM)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞多药耐药(MDR)的影响及机制。方法:选择MDA-MB-231细胞作为研究模型,应用CCK-8检测过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ拮抗剂GW9662、PPARγ激动剂曲格列酮和ABC转运蛋白G家族成员2(ABCG2)抑制剂KO143在时间和剂量效应下对细胞增殖的影响。应用油红O染色检测人脂肪组织提取液(HATES)对细胞脂滴积累的影响。利用HATES模拟ARM,应用顺铂(DDP)和紫杉醇(PTX)作为化疗药物,通过细胞形态、CCK-8及流式Annexin V-PE/7-AAD双染凋亡检测HATES对MDA-MB-231细胞MDR的影响。荧光素酶报告基因检测HATES、GW9662、曲格列酮对MDA-MB-231细胞ABCG2转录活性的影响。Western印迹检测HATES、GW9662对MDA-MB-231细胞PPARγ和ABCG2蛋白表达的影响。Western印迹、CCK-8及流式Annexin V-PE/7-AAD双染凋亡检测HATES对PPARγ-siRNA瞬时转染MDA-MB-231细胞PPARγ及ABCG2蛋白表达、化疗时细胞增殖和凋亡的影响。CCK-8及流式Annexin V-PE/7-AAD双染凋亡检测HATES、GW9662、KO143对MDA-MB-231化疗时细胞增殖和凋亡的影响。结果:25μmol/L GW9662、25μmol/L曲格列酮及10μmol/L KO143处理细胞2 h均不影响细胞增殖,在此基础上进行后续实验。应用的HATES浓度可促进MDA-MB-231细胞脂滴形成且不影响MDA-MB-231细胞的形态、增殖及凋亡(均P>0.05),但在化疗药物存在时可促进细胞增殖并减少细胞凋亡(均P<0.05)。HATES可提高MDA-MB-231细胞的ABCG2转录活性,而阻断PPARγ可抑制该效应(P<0.001)。HATES促进细胞的MDR,沉默PPARγ和使用GW9662及KO143减弱HATES对MDR的影响(均P<0.001)。结论:HATES通过PPARγ/ABCG2途径促进MDA-MB-231细胞的MDR。

体外实验中缺氧对中性粒细胞凋亡的影响

目的:通过在缺氧条件下体外培养中性粒细胞,探讨缺氧对中性粒细胞凋亡的影响。方法:用全反式维甲酸诱导NB-4细胞分化获得中性粒细胞并建立缺氧模型,用流式细胞技术检测缺氧对中性粒细胞凋亡和坏死的影响以及缺氧后CD11b+细胞百分率的变化,用免疫荧光技术检测缺氧对中性粒细胞的细胞膜TNFR1表达强度的影响。结果:缺氧后中性粒细胞增殖减缓,凋亡和坏死受到抑制,细胞膜TNFR1表达下降,CD11b+细胞百分率稍有增高。结论:缺氧可以减缓中性粒细胞增殖,同时抑制中性粒细胞的凋亡。

人脐带间充质干细胞生物学特性及其在难治性疾病中的应用进展

人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)是一种多能干细胞,具有免疫调节功能、旁分泌功能和多向分化潜能等生物学特性。在一定条件下,HUCMSCs经诱导可分化为多种细胞,也可再生成其他组织器官,在临床上具有广泛的应用前景。目前关于难治性疾病多采用药物治疗,很难使受损或功能障碍的细胞恢复正常。因此,深入研究HUCMSCs在移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、肝纤维化、心血管疾病、呼吸系统疾病等疾病中的治疗效果,可以为难治性疾病的治疗提供新思路。同时,HUCMSCs库的建设和发展可促进HUCMSCs技术的产业化和临床应用,从而为临床提供高质量的HUCMSCs注射液。

肿瘤坏死因子α增强全反式维甲酸诱导早幼粒白血病细胞的凋亡

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对全反式维甲酸(ATRA)诱导人早幼粒白血病细胞凋亡的影响。方法分别单独使用ATRA或者联合使用ATRA与TNF-α作用于NB4人急性早幼粒白血病细胞,细胞计数检测细胞增殖,annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞表面CD11b表达的变化。结果与单独使用ATRA相比,联合使用ATRA和TNF-α时,NB4细胞在整个分化过程中增殖速度更慢、凋亡率更高,在分化第2天CD11b阳性细胞的比例更高。结论 TNF-α可能具有增强ATRA诱导早幼粒白血病细胞分化及凋亡的作用。

3种获得中性粒细胞方法的比较及应用的探讨

目的比较诱导髓系白血病细胞株分化法、外周血分离纯化法、诱导造血干细胞定向分化法3种获得中性粒细胞的方法。方法用1μmol/L全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化;用红细胞裂解法结合免疫磁珠法分离纯化外周血中性粒细胞;用Percoll密度梯度离心法结合免疫磁珠法分离纯化外周血干细胞,然后用GM-CSF和G-CSF诱导粒细胞的产生。3种方法获得的细胞通过MGG染色检测细胞形态及中性粒细胞纯度,利用免疫荧光技术检测CD18蛋白的表达及胞内分布特点。结果诱导NB4细胞分化可获得约40%的中性粒细胞,从外周血分离纯化的中性粒细胞纯度约为90%,通过诱导造血干细胞定向分化可获得70%以上的中性粒细胞。免疫荧光结果显示,3种方法获得的中性粒细胞,CD18蛋白的表达强度无明显不同,也都呈现点状分布。结论红细胞裂解法结合免疫磁珠法分离纯化外周血中性粒细胞,纯度高、活性好,有利于快速检测新鲜血液样本中的中性粒细胞;诱导造血干细胞定向分化获得的中性粒细胞,活性高,可在体外维持长达几天之久,可应用于中性粒细胞长时间的体外试验。

IL-17A对卵巢癌顺铂耐药的影响及其机制的研究

目的:探究IL-17A对卵巢癌(OVCA)顺铂(DDP)耐药的影响及其可能的作用机制。方法:应用MTT法检测IL-17A(0.1、1、10、100 ng/m L,处理12、24、48、72 h)对A2780(顺铂敏感卵巢癌细胞株)和OVCAR3(顺铂耐药卵巢癌细胞株)增殖的影响;应用MTT法检测IL-17A(1 ng/m L,处理24 h)对A2780和OVCAR3细胞DDP耐药的影响,并以rh IL-17RA中和抗体(IL-17RA m Ab)和Gli1抑制剂Gant61进行相应的阻断实验;应用Western blotting法检测IL-17A处理A2780和OVCAR3细胞后,细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Hedgehog(Hh)信号通路核转录因子Gli1的蛋白表达,并分别以IL-17RA m Ab和Gant61进行相应的阻断实验。结果:IL-17A对A2780和OVCAR3的细胞增殖无显著性影响,但可显著增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性(P<0.05),分别以IL-17RA m Ab和Gant61进行阻断实验均可消除由IL-17A加剧的A2780和OVCAR3细胞DDP的耐药性;IL-17A可上调A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2,MDR1和Gli1的蛋白表达,分别以IL-17RA m Ab和Gant61进行阻断实验均可抑制IL-17A引起的A2780和OVCAR3细胞中ABCG2,MDR1和Gli1蛋白表达。结论:IL-17A可作用于IL-17RA并激活Gli1介导的Hh信号通路,进而促进耐药相关分子ABCG2和MDR1表达,从而加剧以DDP为基础的OVCA化疗耐药性。

TLR2、TLR4及MyD88高表达与Cm呼吸道感染肺组织炎症相关

目的:探讨沙眼衣原体呼吸道感染过程中C3H/HeN(C3H)小鼠过度炎症反应的机制。方法:C3H与C57BL/6(C57)小鼠鼻腔吸入1×10~3IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Cm),建立沙眼衣原体小鼠肺炎模型,使用RT-PCR检测感染后不同时间点小鼠肺组织Toll样受体TLR2、TLR4及转导蛋白MyD88 mRNA的表达。结果:使用1×10~3IFU的Cm呼吸道感染C3H与C57BL/6(C57)诱导小鼠衣原体肺炎,Cm感染在高易感性的C3H小鼠及低易感的C57小鼠均诱导Toll样受体的表达,但在感染后第7天及第14天,高易感的C3H小鼠肺组织中TLR2和TLR4 mRNA的表达均显著高于C57小鼠,尤其TLR2(P<0.001或P<0.05),进一步研究发现Cm呼吸道感染C3H小鼠肺组织My D88mRNA的表达也显著高于C57小鼠,并在感染后第14天仍维持高表达。结论:Cm呼吸道感染诱导TLR2、TLR4及MyD88在高易感的C3H小鼠肺组织高表达,可能与C3H小鼠肺组织过度炎症反应相关。

IL-17A协同GM-CSF和LPS促进骨髓细胞衍生树突状细胞的分化和成熟研究

目的:探讨IL-17A对小鼠骨髓细胞衍生树突状细胞分化和成熟的影响。方法:分离小鼠骨髓细胞,加入含GM-CSF(20 ng/ml)RPMI1640完全培基培养8 d,诱导小鼠骨髓单个核细胞向DC分化,加入LPS(1μg/ml)继续培养36 h,进一步诱导DC成熟,同时在骨髓细胞衍生诱导DC分化及成熟的不同阶段加入不同浓度的rm IL-17A(10、100 ng/ml),采用流式细胞术检测DC表面共刺激分子的表达,ELISA方法检测DC培养上清中IL-12p40和IL-10水平。结果:rm IL-17A可促进GMCSF诱导骨髓细胞衍生DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达,且具有剂量依赖性,其中以高浓度rm IL-17A刺激组的CD40及MHCⅡ表达增加最显著;在LPS诱导DC成熟阶段加入rm IL-17A,骨髓细胞衍生DC共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达均明显增加,并且随着rm IL-17A浓度的增加,CD86和MHCⅡ的表达水平也随之增高;同时与未加rm IL-17A的对照组相比,低浓度rm IL-17A组LPS刺激骨髓细胞衍生DC分泌IL-12p40和IL-10水平均显著增加(P<0.001),高浓度rm IL-17A组IL-12p40水平显著增高(P<0.001),但IL-10水平没有变化。结论:IL-17A可促进GM-CSF诱导的骨髓细胞衍生DC前体细胞表型发展,并能协同LPS诱导骨髓衍生DC的分化和成熟。

人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立

目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系。方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒。将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒。收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株。荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平。结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90%以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。

外源性IL-6通过STAT3通路促进卵巢癌细胞对顺铂耐药

目的:探讨外源性白细胞介素-6(IL-6)诱导卵巢癌(OvCa)对顺铂(Cisplatin)耐药的作用。方法:6孔板接种A2780细胞,分为对照(Control)组、AG490组、重组人IL-6(rhIL-6)组和rhIL-6+AG490组,应用Western印迹检测rhIL-6对A2780(顺铂敏感OvCa细胞株)的磷酸化信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)蛋白表达的影响。96孔板接种A2780细胞,分为Control组、AG490组、顺铂(Cisplatin)组、AG490+Cisplatin组、rhIL-6组、rhIL-6+AG490组、rhIL-6+Cisplatin组和rhIL-6+AG490+Cisplatin组,CCK8实验检测rhIL-6对A2780细胞增殖的影响。12孔板接种A2780细胞,分为Control组、AG490组、Cisplatin组、AG490+Cisplatin组、rhIL-6组、rhIL-6+AG490组、rhIL-6+Cisplatin组和rhIL-6+AG490+Cisplatin组,细胞凋亡实验检测rhIL-6对A2780细胞顺铂耐药的影响。以36只雌性裸鼠为研究对象,随机分为Control组、rhIL-6组、Cisplatin组、AG490组、rhIL-6+Cisplatin组和rhIL-6+AG490+Cisplatin组,每组6只。腹腔注射A2780细胞,给药4周后颈椎脱臼处死小鼠,检测rhIL-6对OvCa腹腔种植瘤耐药的影响。结果:Western印迹结果显示,与Control组相比,rhIL-6组p-STAT3蛋白表达显著增加(t=6.55,P<0.01);CCK8实验结果显示,与Control组相比,rhIL-6组细胞增殖增加(t=4.148,P<0.05);细胞凋亡实验发现,与Cisplatin组相比,rhIL-6+Cisplatin组细胞凋亡显著降低(t=20.03,P<0.001),与rhIL-6+Cisplatin组相比,rhIL-6+Cisplatin+AG490组细胞凋亡显著增加(t=22.16,P<0.001);小鼠体内实验结果发现,与Cisplatin组相比,rhIL-6+Cisplatin组瘤结节数量和重量显著增加(t=2.783,P<0.05),与rhIL-6+Cisplatin组相比,rhIL-6+Cisplatin+AG490组瘤结节数量和重量显著降低(t=3.306,P<0.05)。结论:外源性IL-6通过STAT3通路诱导OvCa对顺铂耐药。

IL-17A对卵巢癌进展的影响及机制研究

目的:采用动物实验和临床标本探讨白细胞介素-17A(IL-17A)对卵巢癌(OvCa)进展的影响,并探索相应机制。方法:以C57BL/6遗传背景的野生型(WT)小鼠和IL-17A缺陷型(IL-17A-/-)小鼠为研究对象,原位注射相同基因背景来源的小鼠OvCa细胞系ID8构建卵巢原位种植瘤模型,观察IL-17A对小鼠OvCa生长转移的影响。应用Western印迹检测WT小鼠和IL-17A-/-小鼠肿瘤组织中信号转导和转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)表达情况,以探讨IL-17A促进OvCa进展的机制。收集OvCa患者临床病理组织切片标本,应用免疫组化分析IL-17A、FABP4表达与OvCa进展的相关性。结果:WT小鼠造模部位卵巢明显肿大,与周围组织黏连,其表面可见若干瘤结节;IL-17A-/-小鼠卵巢肿大,与周围组织无黏连,表面瘤结节较少。与WT小鼠相比,IL-17A-/-小鼠腹腔瘤结节显著减少(t=5.132,P<0.05)。Western印迹结果显示与WT小鼠相比,IL-17A-/-小鼠肿瘤组织中p-STAT3、FABP4蛋白表达显著降低(均P<0.05)。OvCa患者临床病理标本显示IL-17A、FABP4表达与癌症FIGO分期、转移相关(均P<0.05),并且在OvCa患者中IL-17A与FABP4表达也具有一定相关性(P<0.05)。结论:动物实验和临床标本证实IL-17A通过上调FABP4表达促进OvCa进展。

NB4细胞和HL60细胞向粒细胞分化过程中细胞表面CD11b和CD18表达的比较

目的:比较髓系白血病细胞株NB4细胞和HL60细胞向粒细胞分化过程中细胞表面抗原CD11b和CD18的表达。方法:用全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞和HL60细胞向粒细胞定向分化,用MGG染色法进行初步鉴定,用FACS检测并比较两株细胞在分化前后细胞表面CD11b和CD18的变化,用Western blot检测两株细胞分化前后CD18的蛋白表达。结果:与分化前相比,两株细胞分化后细胞表面CD11b和CD18的表达均明显升高,并且这样的变化在NB4细胞中较HL60细胞更加显著。结论:分化NB4细胞可能较分化HL60细胞是更方便的粒细胞模型。

脐带采集液中抗生素的合理选择

目的:了解脐带采集过程中脐带污染菌的种类,为脐带采集液中合理添加抗生素提供实验依据。方法:采用BacT/Alert 3D240培养系统进行微生物培养;采用梅里埃API鉴定系统鉴定菌种;采用ATB药敏系统进行药敏试验;采用油红O染色和茜素红染色,测定人脐带组织间充质干细胞(HUCMSCs)的成脂分化和成骨分化潜能。结果:采集1562份脐带,微生物培养阳性的386份脐带采集液共检出细菌及真菌438株,其中革兰阴性菌193株(44.1%),主要为大肠埃希氏菌,其对头孢西丁的敏感率为90.3%;革兰阳性菌210株(48.0%),主要为肠球菌,其次是葡萄球菌和链球菌,三者对青霉素的敏感率分别为93.1%、19.7%、92.9%;真菌35株(8.0%),主要为白假丝酵母菌,真菌对两性霉素B的敏感率为100%。进一步的结果显示,与对照组比较,头孢西丁、青霉素、两性霉素B和三者混合使用对HUCMSCs生长、增殖和多向分化均无影响(P>0.05)。结论:脐带采集污染优势菌株依次为大肠埃希菌、粪肠球菌、白假丝酵母菌;脐带采集液中加入头孢西丁、青霉素和两性霉素B可以显著减少细菌和真菌污染。

IL-17A可以促进卵巢癌的腹腔转移

目的:探讨白细胞介素(IL)-17A对卵巢癌(OvCa)腹腔转移的影响。方法:以C57BL/6为遗传背景的野生型(WT)小鼠和IL-17A缺陷(IL-17A-/-)小鼠为研究对象,腹腔注射同基因小鼠OvCa细胞系ID8,检测内源性IL-17A对OvCa腹腔种植瘤生长的影响。应用MTT法检测不同浓度的重组小鼠IL-17A(rmIL-17A)对ID8细胞增殖的影响;应用划痕实验检测不同浓度的rmIL-17A对ID8细胞迁移能力的影响;应用Transwell侵袭实验检测不同浓度的rmIL-17A对ID8细胞侵袭能力的影响。结果:与IL-17A-/-小鼠相比,WT小鼠腹腔内肠系膜、腹膜后淋巴结、脾脏和肾脏表面等处均见密集瘤结节转移灶,且腹腔内瘤结节数量显著增多(均P<0.01)。体外实验结果显示,与对照组相比,不同浓度的rmIL-17A对ID8细胞增殖无影响(均P>0.05);与对照组相比,10 ng/mL的rmIL-17A作用6 h后可促进ID8细胞迁移,1 ng/mL和10 ng/mL的rmIL-17A作用12 h后可显著促进ID8细胞迁移(均P<0.05);与对照组相比,干预24 h后,1 ng/mL和10 ng/mL的rmIL-17A对ID8细胞的侵袭能力均有促进作用(均P<0.05)。结论:IL-17A可以促进卵巢癌的腹腔转移。

γδT细胞在小鼠沙眼衣原体感染中通过促进Th17免疫应答发挥免疫保护作用

目的探讨γδTT细胞在沙眼衣原体呼吸道感染中的作用以及对衣原体特异性适应性免疫应答的影响。方法WT（C57BL／6）小鼠和TCRδ^-/-小鼠（C57BL／6背景）经鼻腔吸入1×10^3IFU的沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Chlamydia muridarum，Cm），建立沙眼衣原体小鼠呼吸道感染模型。酶免疫法检测感染不同时间的小鼠肺组织衣原体生长情况，用衣原体包涵体形成单位（IFU）代表衣原体繁殖；ELISA法测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-17的产生；细胞内细胞因子染色检测小鼠肺组织CD3^＋CD4^＋T细胞IFN-γ（Th1免疫应答）及CD3^＋CD4^＋T细胞IL-17（Th17免疫应答）的水平，确定γδT细胞对宿主特异性抵抗衣原体的Th1、Th17免疫应答的调节作用。结果经鼻腔吸入一定剂量Cm诱导小鼠沙眼衣原体肺炎，与WT小鼠比较，TCRδ^-/-小鼠感染Cm早期体重下降更明显，但是两组小鼠肺组织衣原体繁殖水平未见显著差异。ELISA结果显示，WT与TCRδ^-/-小鼠在Cm呼吸道感染后的第3天和第7天IFN-γ分泌无显著差异，感染第7天TCRδ^-/-小鼠IL-17分泌显著低于WT小鼠；细胞内细胞因子染色结果提示感染第3天和第7天TCRδ^-/-小鼠CD3^＋CD4^＋T细胞分泌IL-17的量显著低于WT小鼠，IFN-γ未见显著差异。结论γδT细胞通过促进抗衣原体特异性的Th17应答发挥免疫保护作用。

Anti-CD24抗体促进刀豆蛋白A诱导的小鼠急性肝损伤的实验研究

目的：探究anti-CD24中和抗体对刀豆蛋白A（ ConA）诱导急性肝损伤的调节作用及其可能的分子机制。方法建立ConA诱导小鼠急性肝损伤的实验模型,观察anti-CD24中和抗体（200μg/鼠）和ConA（10 mg/kg）联合注射组小鼠肝脏解剖学上的改变；HE染色观察小鼠肝组织损伤程度；血清学方法检测小鼠肝功能指标谷丙转氨酶（ ALT）的变化；流式细胞术分析anti-CD24中和抗体对小鼠肝内Kupffer细胞（ KC）亚型分布的影响；胞内染色分析anti-CD24中和抗体对M1型KC细胞分泌TNF-α的影响。结果从解剖学上,anti-CD24中和抗体和ConA联合注射组（实验组）肝组织肿大；HE染色观察实验组小鼠肝脏出现明显的肝细胞点状坏死和炎性细胞浸润；实验组小鼠血清ALT水平显著高于对照组（P〈0.001）。流式细胞术分析表明：实验组小鼠M1型KC细胞百分数显著增加（P〈0.01）,M2型KC细胞百分数变化不明显。胞内染色流式细胞术表明：anti-CD24中和抗体显著促进小鼠KC细胞分泌TNF-α（P〈0.001）。结论 Anti-CD24中和抗体可促进ConA诱导的小鼠急性肝损伤,这可能与CD24中和抗体促进M1型KC细胞分泌TNF-α有关,其免疫机制与信号传导通路正在进一步探讨之中。

树突状细胞在沙眼衣原体小鼠肺炎株呼吸道感染中免疫保护作用的研究

目的探讨树突状细胞(dendritic cells,DC)在沙眼衣原体小鼠肺炎株(Chlamydia muridarum,Cm)呼吸道感染中的作用以及对适应性免疫应答的影响。方法C57BL/6小鼠经鼻腔吸入1×10^(3)包涵体形成单位(inclusion-forming units,IFU)Cm建立小鼠呼吸道感染模型。流式细胞术检测感染后0、3、7 d脾组织中总CD11c^(+)MHCⅡ^(+)DC比例和共刺激分子(CD40、CD80和CD86)表达情况;qPCR检测小鼠脾组织中DC细胞因子IL-12p40、IL-10和IL-6 mRNA的表达;磁珠分选出Cm感染后7 d的小鼠脾组织DC并过继转移给受体小鼠,于感染后14 d利用细胞内细胞因子染色检测受体小鼠Th1应答水平。结果Cm感染诱导小鼠脾组织DC大量浸润并且共刺激分子表达增加;脾组织DC细胞因子IL-12和IL-10 mRNA的表达在感染后3 d达到高峰;将Cm感染小鼠脾组织DC过继转移给受体小鼠,受体小鼠感染Cm后疾病减轻,肺组织衣原体繁殖降低,且肺和脾组织中的Th1细胞比例显著升高。结论DC在Cm感染后成熟、活化并促进Th1细胞免疫应答,在衣原体呼吸道感染中发挥免疫保护作用。

沙眼衣原体小鼠肺炎株呼吸道感染诱导肺组织中性粒细胞浸润及活化

目的：探讨小鼠沙眼衣原体肺炎感染中中性粒细胞（ polymorphonuclear neutrophils， PMN）的募集、活化及诱导其趋化的免疫学机制。方法 C57BL/6（C57）小鼠鼻腔吸入3×10^3 IFU（in-clusion-forming units）沙眼衣原体小鼠肺炎株（Chlamydia muridarum，Cm）建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。取感染后不同时间点小鼠肺组织进行组织病理学染色；通过检测肺组织内髓过氧化物酶（ myelo-peroxidase，MPO）的含量，检测 PMN 在肺组织聚集；分离小鼠肺组织单个核细胞，Giemsaˊs 染色计数肺组织炎症细胞种类；流式细胞术检测 CD11b^＋ Gr1^＋ PMN 细胞百分率及 CD11b^＋ PMN 活性水平；应用RT-PCR 技术检测 Cm 感染后肺组织内与 PMN 募集相关的趋化性细胞因子（MIP-2、LIX、KC、MCP-1）的表达，探讨小鼠 Cm 呼吸道感染过程中 PMN 趋化机制。结果一定剂量的 Cm 呼吸道吸入诱导C57小鼠衣原体肺炎，与对照组（感染第0天）比较，肺组织内有大量炎性细胞浸润，主要包括 PMN、单核细胞、淋巴细胞，其中 PMN 在肺内的聚集早于单核细胞；Cm 感染诱导小鼠肺组织 MPO 含量升高，在感染第7天达到高峰，第14天虽然有所下降，但仍明显高于对照组；流式结果显示，Cm感染后，CD11b^＋Gr1^＋细胞百分比、PMN 总数均显著高于对照组，同时 PMN CD11b 分子的表达在感染后也显著升高，说明 Cm 感染能诱导小鼠肺组织内 PMN 大量聚集并活化。RT-PCR 结果显示，Cm 感染后小鼠肺组织内与 PMN 募集相关的趋化性细胞因子（MIP-2、LIX、KC、MCP-1）的含量明显升高，提示Cm感染上调 PMN 相关趋化性细胞因子的表达，从而吸引大量 PMN 在肺部聚集参与炎症反应。结论一定剂量的 Cm 可以诱导感染小鼠肺组织内 PMN 相关趋化性细胞因子的分泌，从而使 PMN 在肺组织内大量浸润并活化，在抵抗衣原体感染中发挥重要作用。

沙眼衣原体呼吸道感染诱导γδT细胞在肺组织增殖并产生大量IFN-γ及IL-17

目的探讨小鼠沙眼衣原体呼吸道感染不同时期γδT细胞的增殖、活化及细胞因子的产生。方法C57BL／6小鼠鼻腔吸入3×10^3IFU（inclusion-forming units）沙眼衣原体小鼠肺炎株（Chlamydia muridarum，Cm）建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。取感染后不同时间点小鼠肺组织进行单个核细胞分离，利用流式细胞术检测小鼠肺CD3^＋TCRγδT细胞百分率，并检测γδT细胞表面分子CD69的表达水平；利用细胞内细胞因子染色技术检测γδT细胞IFN-γ和IL-17的产生。结果一定剂量的Cm经呼吸道感染诱导小鼠衣原体肺炎。与未感染的对照组比较，Cm感染诱导小鼠肺组织γδT细胞百分率及γδT细胞总数逐渐升高，于感染后第7天达到高峰，随后逐渐下降；肺组织γδT细胞表面活化分子CD69表达于感染后第3天达高峰，此后略有降低。Cm感染诱导γδT细胞分泌大量IFN-γ、IL-7，于感染后第3天达到高峰；相比αβT细胞，γδT胞主要在感染早期（感染后前3天）分泌大量IFN-γ和IL-17，而后期CD3^＋CD4^＋T细胞产生IFN-γ和IL-17的能力逐渐高于γδT细胞。结论一定剂量的Cm呼吸道感染可以诱导小鼠γδT细胞在感染局部大量聚集及活化，γδT细胞是宿主抗衣原体免疫应答早期分泌IFN-γ和IL-17的主要细胞类型。

Tudor-SN蛋白一级结构间断的SN5结构域质粒的拼接构建

目的 实现Tudor-SN蛋白TSN结构域内间断的SN5基因片段（SN5α、SN5β）的拼接以及与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中的融合表达.方法 利用Geno 3D对拼接的SN5进行结构预测.以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR分别扩增出SN5α和SN5β的基因,双酶切并纯化后,先将SN5β引入pEGFP-C2,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5β,再将SN5α引入pEGFP-C2-SN5β,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5.将pEGFP-C2-SN5β/ SN5脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达.结果 ① 拼接的SN5结构预测显示与TSN完整结构中的SN5高度重合;②对重组质粒进行双酶切鉴定可见SN5α、SN5β、SN5的cDNA片段;③ 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达;④ Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白.结论 pEGFP-C2-SN5/SN5β重组质粒构建成功,SN5α和SN5β在pEGFP-C2中实现了顺序拼接;目的片段可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达,融合蛋白可与抗GFP抗体结合用于蛋白检测.