珍珠黄杨DNA的提取方法比较及ISSR反应体系的优化

为从珍珠黄杨幼叶中提取高质量的总DNA,比较了1%CTAB、2%CTAB、4%CTAB和1.5%SDS4种DNA提取方法。结果表明:2%CTAB提取的DNAA260/A280值最好,ISSR-PCR扩增效果最佳,是有效提取珍珠黄杨基因组DNA的方法。并在此基础上,以(CT)8G为引物,采用单因素实验法,确立了适合珍珠黄杨的ISSR-PCR反应体系:在总体积20μL的反应体系中,含30ngDNA模板,2.0mmol/LMg2+,0.30μmol/L引物,0.20mmol/LdNTPs,1UTaq酶。

磁珠富集法筛选马尾松微卫星标记

将马尾松核基因组DNA用Sau3A Ⅰ酶切后，电泳回收300-1000bp片段。在回收的片段上连接接头PCR后与用生物素标记的微卫星探针（AC）15、（AG）15杂交运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将获得的序列通过PCR扩增后，连接pGEM-T载体，转化入感受态大肠杆菌，得到微卫星序列文库。然后用PCR法直接对文库进行扩增，获得58个阳性克隆，经测序分析，获微卫星序列33个，并成功设计出马尾松微卫星引物19对。