柑橘衰退病和碎叶病复合感染病原的脱毒研究

以带毒柑橘品种为试材,采用植物中药制剂处理与热处理结合、茎尖微芽嫁接与植物中药制剂处理结合,用RT-PCR法检测病原带毒情况,并在药剂处理后1、3、5、7、9 d取样,检测抗性相关酶活性的含量变化,结果表明:采用板蓝根和黄芩混合中药制剂处理8次,结合热处理,在PC板制成的温室(白天40℃(6 h/d),晚上25℃,处理50 d)中,可有效地脱除试验苗木中柑橘衰退病和柑橘碎叶病复合感染病原;对柑橘茎尖微芽嫁接苗进行板蓝根和黄芩混合中药制剂脱毒处理后苗木经RT-PCR法检测表明:85.7%植株可以脱除柑橘衰退病和柑橘碎叶病病毒;药剂处理后PPO、POD、SOD酶活性与对照相比均有所提高。

柑橘衰退病毒多克隆和单克隆抗体的制备及检测效果分析

通过改进提纯方法获得了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）的提纯液,其产量为1mg/100g植物组织.用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,间接ELISA效价为1：25 600.用CTV免疫小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株.对其中4株单克隆腹水抗体进行分析的结果表明,这些抗体的ELISA效价为1：51 200～1：204 800,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b.用所制备抗体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA（TAS-ELISA）可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵敏度高.同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究.

苹果茎沟病毒梨分离物外壳蛋白基因的克隆和序列分析

选取生物学和血清学特性存在较大差异的苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)梨分离物P-6-1-17、P-4- 1-69、P-L2和P-D-21,采用RT-PCR法对3’端进行扩增,所获扩增片段经序列测定,全长分别为1089 nt(P-6-1-17、P-L2)和 1069 nt(P-4-1-69、P-D-21)。4个分离物的CP基因均由714 nt组成,其核苷酸和推导编码蛋白氨基酸序列同源性分别为 89．8％-96．4％和94．9％-97．9％。将我国4个分离物的CP基因与已报道ASGV分离物及分子变种进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明我国ASGV分离物至少可分为2个组群,其中生物学表现明显不同于其它分离物的P-L2, 其CP基因核苷酸序列显示较大的变异。

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。

茶尺蠖核型多角体病毒多克隆抗体的制备及检测应用

以纯化的茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EcobNPV)作为抗原免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,Indirect-ELISA效价为1∶51 200;工作浓度分别为EcobNPV 1∶1 600、兔抗血清1∶3 200。用所制备的多克隆抗体对提纯的多角体进行Western-blot分析表明制得的抗体对茶尺蠖核型多角体病毒有良好的特异性。应用于不同来源茶园昆虫多角体病毒分离株的检测,取得了理想的检测效果。

聚-γ-谷氨酸对黄瓜产量和果实品质的影响

本文研究了复合肥与聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)的不同配方处理对黄瓜产量和果实品质的影响。结果表明,与对照相比,处理3(复合肥配施150 mL/L、3.5%的PGA发酵液)和处理4(复合肥配施300 m L/L、3.5%的发酵液)能使果实长度增加,果形均匀一致,亮度增加,果实表面更富有光泽,果实产量提高;与对照相比,这两组处理后黄瓜产量分别提高了53.2%和47.1%,且单株挂果数极显著提高(P<0.01)。在黄瓜的内在品质上,γ-PGA也有增益作用。可见,γ-PGA与N、P和K的配合及使用,有利于提高黄瓜的生产效益。

PGA增效剂在温州蜜柑中施用效果的评价

研究了聚γ-谷氨酸(PGA)肥料增效剂和增效肥对温州蜜柑果重、外观和品质的影响。结果表明,施用不同浓度的聚γ-谷氨酸肥料增效剂后,温州蜜柑的果实单果重、榨汁率和维生素C含量3个指标与对照相比产生了明显差异。200mg/L的聚γ-谷氨酸使温州蜜柑单果重极显著增加;添加0.2g/L磷酸二氢钾时,300mg/L的聚γ-谷氨酸处理使果实的榨汁率显著增加,200mg/L的聚γ-谷氨酸处理后的果实维生素C含量极显著增加。在宜昌市的示范试验结果表明,聚γ-谷氨酸增效复合肥使可溶性固形物和维生素C含量分别提高了35.4%和11.7%;200mg/L的聚γ-谷氨酸水溶剂灌根处理使可溶性固形物和维生素C含量分别提高了40.2%和19.3%。荆门市的示范试验结果表明,聚γ-谷氨酸增效剂处理可以明显改善大棚栽植柑橘的外观品质,使露地的果实整齐一致,果形圆正,着色均匀,具有天然打蜡的效果,外观表现最好。

聚-γ-谷氨酸对‘无籽椪柑’和‘翡翠柚’品质的影响

探讨了肥料增效剂聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,PGA)对改进‘无籽椪柑’和‘翡翠柚’果实品质的影响。结果表明,100和200 mg·L-1PGA处理后,‘无籽椪柑’果实的可溶性固形物含量极显著高于CK,果实变甜,内含物质更丰富,单果重极显著高于CK,果实增大,且果个均匀;100 mg·L-1PGA处理后,果实的可滴定酸含量极显著高于CK,果实风味更浓;200 mg·L-1PGA处理后,果实的果皮重极显著高于CK。200和300 mg·L-1PGA处理后,‘翡翠柚’果实的可溶性固形物含量极显著高于CK;200 mg·L-1PGA处理后,果实的Vc含量极显著高于100 mg·L-1PGA处理及CK;300 mg·L-1PGA处理后,果实的可食率极显著高于100 mg·L-1PGA处理及CK,果皮光滑度明显改善。

聚-γ-谷氨酸对柑橘苗木性状和GABA的影响

通过株高、冠径及酶活的测定研究聚-γ-谷氨酸(PGA)水溶液灌根对柑橘苗木个体性状和叶片中抗性相关酶的影响,并采用亲水相互作用色谱(HILIC LC-MS/MS)分析了PGA灌根前后叶片中200个靶向代谢物含量的变化。结果表明:PGA处理能促进苗木株高、冠径和嫁接苗分枝数的增加;PGA处理后,柑橘叶片中超氧化物歧化酶(SOD,抗氧化物保护酶)、过氧化物酶(POD,参与过氧化产物的清理)和多酚氧化酶(PPO,酚类物质代谢的参与酶)的活性增加;PGA处理后,柑橘叶片中L-谷氨酸含量下降73.2%倍,而γ-氨基丁酸(GABA)含量增加了1.6倍,N6-甲基腺嘌呤含量提高2.3倍。靶向代谢物分析获得109个代谢物的定量结果,其中,13种代谢物对照与处理的差异达到显著水平。

聚-γ-谷氨酸促进柑橘苗木生长和矿物元素吸收的研究

聚-γ-谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid,PGA)是由微生物发酵获得的一种多肽类化合物,为一种绿色环保的肥料增效剂,在农业领域具有广泛的应用前景。本试验以柑橘实生苗和嫁接苗为材料,研究了PGA水溶液对柑橘苗木的生长指标、生理指标和矿物元素含量的影响。结果表明:PGA处理能促进幼苗增高,根系增长,使根系鲜质量和叶面积增加;可显著提高叶绿素a和可溶性蛋白质含量;100 mg/L和200 mg/L的PGA处理能使柑橘嫁接苗的株高、冠径和干径均显著提高;PGA与0.2%KH2PO4和0.2%尿素配合施用能显著增加嫁接苗的冠径和干径。此外,PGA处理还可提高叶片中P、Na和Zn元素的含量,增加磷元素的吸收,促进苗木的生长。

聚-γ-谷氨酸提高藤稔葡萄品质的研究

研究了聚-γ-谷氨酸(PGA)肥料增效剂对藤稔葡萄外观和内质的影响。结果表明,经PGA50、100和200mg/L等3种浓度分别进行两次灌根处理,藤稔葡萄的纵、横径有了明显增长,其中200mg/L处理使果实纵径呈显著性增长,与对照(清水)相比增幅为7.7%;200mg/L处理使果实可溶性固形物、维生素C、可溶性蛋白含量呈极显著性增长,比对照(清水)分别增加11.4%、60.7%和28.7%。同时就聚-γ-谷氨酸处理藤稔葡萄后,对其可食率、果肉中的可滴定酸、还原糖和果皮中单宁含量的变化规律作了分析。综合考虑,选用PGA 200mg/L灌根处理藤稔葡萄,可改善其果实品质和着色质量,促进表皮果粉的积累。

红肉猕猴桃离体快速繁殖技术研究

以红阳红肉猕猴桃为试材,通过调整植物生长调节剂浓度与种类,筛选出适宜于红肉猕猴桃植株愈伤组织形成、不定芽增殖和植株生根的最佳配方。结果表明:在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中,增殖率可达87.5%;使用MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA培养基,不定芽的增殖系数达到最高值3.7个;在1/2 MS+0.7 mg/L IBA培养基中,不定芽诱导生根效果较佳。

聚-γ-谷氨酸改善赣南纽荷尔脐橙品质的研究

聚-γ-谷氨酸(γ-PGA,以下简称PGA)是一种天然的水溶性聚合氨基酸,具有生物可降解性、对人体和环境无毒害等优点。本试验开展了PGA对江西赣南纽荷尔脐橙外观和内在品质影响的研究。实验结果表明:(1)PGA能显著提高纽荷尔脐橙的单果重,增幅可达17.26%~19.13%,春肥施用时添加100mg/L的PGA灌根,能够使纽荷尔脐橙单株产量提高;(2)PGA可以加快纽荷尔脐橙果实的纵向生长,增加可食率,以春肥和壮果肥都施用200mg/L的PGA灌根效果明显;(3)PGA对可溶性固形物有一定的影响,纽荷尔脐橙试验中春肥和壮果肥都添加200mg/L PGA灌根可增加可溶性固形物0.6%;PGA处理降低了纽荷尔脐橙的有机酸,可以增大固酸比,以春肥和壮果肥都施用200mg/L PGA灌根效果最明显,可滴定酸含量分别降低15.6%和11.8%,果实大小均,表面光滑。

聚-γ-谷氨酸提高龟井温州蜜柑品质的研究

本文研究了聚-γ-谷氨酸(PGA)肥料增效剂对柑橘品种——龟井温州蜜柑品质和产量的影响,结果显示:施用45%洋丰复合肥时添加200mg/L的PGA可以使果实单果重极显著地增加;PGA处理比对照单株产量增加2.5%~4.9%;PGA处理(处理A)使可溶性固形物含量提高0.37%;维生素C含量比对照明显增加19.90%~30.81%;PGA在施用春肥时施用,可以使果实的整齐度提高,果实大小均匀,形状端正,着色均匀,富有光泽。

聚-γ-谷氨酸对广西龙滩珍珠李品质的影响

探讨了聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,PGA)对广西地方优良品种龙滩珍珠李外观及内在品质的影响。结果表明,2015、2016年200 mg·L^(-1)PGA处理后,龙滩珍珠李单果重均极显著高于清水处理(CK);2015年100和200 mg·L^(-1)PGA处理后,Vc含量分别比CK提高了16.8%和24.6%,其中200 mg·L^(-1)PGA处理极显著高于CK,2016年200 mg·L^(-1)PGA处理后,Vc含量分别比CK和100 mg·L^(-1)处理提高了5.4%和16.2%,且差异达显著水平;2015年100和200 mg·L^(-1)PGA处理后,还原糖含量分别比CK提高了18.2%和36.1%,其中200 mg·L^(-1)PGA处理极显著高于CK,2016年还原糖含量分别比CK提高了49.3%和80.1%,差异均达极显著水平;2015、2016年200 mg·L^(-1)PGA处理后,果实蛋白质含量均高于CK和100 mg·L^(-1)处理。2015、2016年PGA对龙滩珍珠李外观及内在品质影响的变化趋势相似。

两种芽孢杆菌共处理对感染黄龙病的柑桔苗的作用

以南丰蜜桔和沙糖桔黄龙病感病苗为试材,利用贝莱斯芽孢杆菌TD2-1(Bacillus velezensisi TD2-1)和解淀粉芽孢杆菌TD2-2(Bacillus amyloliquefaciens TD2-2)固体发酵培养物等量混合后配制的悬浊液对苗木进行多次灌根处理,采用qPCR(quantitative polymerase chain reaction)和PCR(polymerase chain reaction)方法对处理前和处理后的叶脉和枝皮进行了黄龙病病原的分子检测,并对相关生理指标和根部特征进行了分析和观察。结果表明,经两种菌剂15次灌根处理,南丰蜜桔苗木的黄龙病阳性率从100%降低至53.3%;与清水对照组相比,菌剂处理组的叶片胼胝质含量降低了18.37%,超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白氧化还原酶、过氧化氢酶和过氧化物酶均有所提高,而褐变根系明显减少。感病沙糖桔苗木经过23次菌剂处理后,新根发达,褐变现象减轻。反相高效液相色谱分析表明,解淀粉芽孢杆菌TD2-2有表面活性素产生。

聚-γ-谷氨酸提升柠檬产量和品质的研究

本文配合春肥和壮果肥的施用,用不同浓度的聚-γ-谷氨酸(PGA)对尤力克柠檬进行灌根试验,研究了PGA对柠檬产量和品质的影响。结果表明:经过3种不同浓度(50、100和200mg/L)的PGA灌根处理,柠檬果实单果重均比对照有所提高,分别增加了62.2%、79.5%和28.3%。PGA浓度为50、100mg/L时,果实的可滴定酸含量分别比对照提高了4.3%和2.9%;果色比对照更鲜艳,果实横径和纵径均有所增长。PGA浓度为200mg/L时,果实中的还原糖含量比对照的增加12.77%,增幅达到极显著水平;蛋白质含量比对照增加7.51%,差异达到显著水平。

葡萄卷叶伴随病毒-3外壳蛋白的原核表达及其特异性抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒-3(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)中国分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)基因。序列分析结果表明,cp基因的长度为942bp,与已报道的其它GLRaV-3分离物的cp核苷酸相似性为91%～99%,编码的氨基酸相似性为95%～100%。将此基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,cp在大肠杆菌中可表达出分子量约为35kDa的蛋白。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)及斑点免疫结合测定(DBIA)结果显示,制备的特异抗血清可用于检测田间感病葡萄样品中的GLRaV-3。

柑橘黄龙病病原菌nrdB基因的原位杂交分析

柑橘植株是否感染黄龙病,可通过qPCR检测其病原韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter Asiaticus,CLas)来判断,但是不同组织样本影响检测结果,因此有必要研究韧皮部杆菌在不同组织中的定位。以柑橘黄龙病韧皮部杆菌的核糖核苷酸还原酶(RibonucleotideReductase,RNR)β亚基基因序列为依据,设计和制备123 bp的RNA探针,经原位杂交试验,在显微镜下能清晰地观察到阳性植株筛管和伴胞中的可视化蓝色杂交信号,导管呈环纹结构。CLas在不同器官中的分布存在显著差异,与新生组织根尖和茎尖相比,RNR基因在枝皮、叶柄、叶脉的韧皮部中的定位更准确。原位杂交的可视化结果与qPCR检测结果一致。

利用Gateway技术筛选Candidatus Liberibacter asiaticus致病相关基因研究

柑橘黄龙病是危害全球柑橘产业健康发展的最严重病害之一,病原为韧皮部限制性细菌,我国的柑橘黄龙病由亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CaLas)引起。由于该病原菌难以获得离体纯培养,从而限制了其致病分子机制的研究。本试验根据已经报道的植物病原细菌致病相关基因特点,从黄龙病菌亚洲种Psy62菌株全基因组序列(Psy62:NC_012985.1)中选取3个假定致病相关基因,分别标记为PalCa _(Las)、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las),利用Gateway技术的同源重组原理,将3个基因通过BP反应和LR反应,分别构建到植物表达载体psk103中,接种本生烟(Nicotiana benthamiana)后,通过瞬时表达筛选可诱导_(N.)benthamiana产生过敏性坏死反应的功能基因。经过PCR克隆和测序验证,PalCa _(Las),、MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)基因均成功构建至植物表达载体上。本生烟瞬时表达试验证实:当含有目的基因的根癌农杆菌菌悬液OD600值介于_(0.)6_(~0.)^(8,)测试本生烟苗龄6周左右,PalCa _(Las)基因在接种4 dpi时可引发明显的HR(hypersensitive reaction)反应,12 dpi时HR反应更为强烈。同等条件下MotCa _(Las)和HlyCa _(Las)均不能引发类似反应。由此证实,Gateway技术可成功用于筛选CaLas致病相关基因,PalCa _(Las)基因可能在CaLas致病过程中发挥重要作用。该报道为国内首次采用Gateway技术进行CaLas致病相关基因功能研究,为后续开展CaLas病原寄主互作分子机制研究奠定了基础。