恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在牛蛙体内的残留消除规律研究

为研究恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在牛蛙(Lithobates catesbeiana)体内药代动力学及分布,明确恩诺沙星在牛蛙体内的最大残留限量及休药期。本实验进行牛蛙单次口灌10%恩诺沙星粉混悬液(20 mg/kg·bw),在0.5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、336、480 h分组织取样检测实验。研究显示:恩诺沙星和环丙沙星在牛蛙血液中的达峰时间(T_(max))相同为1 h,峰浓度(C_(max))分别为26.592μg/mL、2.256μg/mL;恩诺沙星在牛蛙肌肉、肝脏、肾脏、脑中的T_(max)均为8 h,C_(max)分别为10.21、13.84、17.52、3.95 mg/kg;环丙沙星在牛蛙肌肉、肝脏、肾脏的T_(max)分别为12、8、12 h,C_(max)分别为1.362、20.46、4.07 mg/kg,在脑中未检测出环丙沙星。结果表明:恩诺沙星在牛蛙体内吸收迅速,21.90%~40.35%恩诺沙星转化为环丙沙星,与鱼类和甲壳类生物相比,环丙沙星在牛蛙体内更易消除;恩诺沙星在牛蛙体内的最大残留限量MRL为108.22μg/kg;单剂量10%恩诺沙星粉(20 mg/kg bw)适用于治疗由于嗜水气单胞菌(MIC:0.1μg/mL)患病牛蛙;牛蛙在室温为25℃左右的饲养环境下,建议休药期不低于514.24 h(22 d)。

牛蛙腐皮病病原菌分离鉴定及药敏试验

【目的】明确浙江嘉善某养殖场引起牛蛙腐皮病的致病菌,并探究益生菌与牛蛙腐皮病病原菌间的相互作用,为今后利用益生菌防控牛蛙腐皮病的发生提供技术支持。【方法】通过常规的细菌分离纯化、人工回归感染试验、生理生化特性鉴定及16S r DNA序列扩增,确定引起牛蛙腐皮病的致病菌;根据药敏试验筛选抗菌药物,并从生物防控的角度探究枯草芽孢杆菌等益生菌与致病菌间的相互作用。【结果】从患病牛蛙的内脏及体表溃烂处共分离获得9株疑似致病菌株,经人工回归感染试验确定菌株NWt-2为引起牛蛙腐皮病的致病菌;综合其形态学特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果,可确定菌株NWt-2为布韦不动杆菌(Acinetobacter bouvetii)。菌株NWt-2对丁胺卡那、庆大霉素、哌拉西林、头孢氨苄和硫酸阿米卡星等5种抗菌药物高度敏感,对青霉素、复方新诺明、诺氟沙星、氟苯尼考、复方磺胺嘧啶、盐酸林可霉素和盐酸大观林可霉素等7种抗菌药物不敏感(耐药)。浓度为105CFU/mL的枯草芽孢杆菌和紫色杆菌对菌株NWt-2有一定的抑制作用,抑菌圈直径分别为1.45±0.46和0.97±0.38 mm。【结论】布韦不动杆菌是引起浙江嘉善养殖牛蛙发生腐皮病的致病菌,可选用丁胺卡那、庆大霉素、哌拉西林、头孢氨苄和硫酸阿米卡星等抗菌药物进行防治。鉴于枯草芽孢杆菌对布韦不动杆菌具有一定的抑制效果,在当前病原菌对抗菌药物普遍存在耐药性的情况下,选择枯草芽孢杆菌等益生菌进行生物防控具有可行性。

基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法

【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串联DNA特征序列的属内菌种鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。【方法】以2020—2021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种气单胞菌为研究对象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定。【结果】在基于16S rRNA序列构建的系统发育进化树中,中间气单胞菌、嗜水气单胞菌、达卡气单胞菌、肠源气单胞菌等聚类在不同分支上,未能形成独立的种属进化分支;在基于gyrB基因构建的系统发育进化树中,达卡气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌聚类在同一分支上,而异嗜糖气单胞菌和维氏气单胞菌聚类在另一分支上。将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树建树,能完全有效分离气单胞菌属的不同菌株,将不同种的气单胞菌独立聚为一支,较好地实现种间区分。【结论】将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树,较基于16S rRNA序列或gyrB基因单独构建系统发育进化树具有更高的分辨力,是一种理想的保守序列相似性高的属内菌种鉴定方法。因此,在16S rRNA测序鉴定为气单胞菌的情况下可再次以gyrB基因为测序对象,获得序列信息后与16S rRNA序列串联构建系统发育进化树,能更加精确地将气单胞菌鉴定到种水平。

中华绒螯蟹致病性维氏气单胞菌的分离鉴定、药敏特性及其组织病理学观察

【目的】查明引起江苏省连云港市某养殖场中华绒螯蟹死亡的病原菌及其药敏特性与组织病理特征,为该病的临床诊断和药物防控提供科学依据。【方法】采用传统方法从患病中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定其致病性,利用API ID32E细菌生化鉴定试剂条和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定,以纸片扩散法测定病原菌的药敏特性,并通过常规石蜡切片观察患病中华绒螯蟹肝胰腺和肠道等病灶组织的病理特征。【结果】从患病中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株具有致病性的病原菌株(HXH1),经生理生化特性鉴定和16S rRNA序列分析确定其为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。HXH1菌株对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为6.92×10^4CFU/mL,对复方新诺明、杆菌肽、奈替米星、氟苯尼考、多粘菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、磺胺异噁唑、链霉素和甲氧嘧啶等14种抗生素高度敏感,对罗红霉素中度敏感,对多西环素、萘啶酸、阿莫西林、四环素和吡哌酸等5种抗生素已产生耐药性(不敏感)。与健康中华绒螯蟹相比,患病中华绒螯蟹的肝胰腺和肠道存在明显病理变化,具体表现为:肝胰腺细胞排列极其紊乱,局部可见坏死细胞,细胞核固缩深染;局部肠黏膜上皮组织溶解脱落至肠腔内。【结论】维氏气单胞菌对中华绒螯蟹具有较强的致病性,通过引起肝胰腺和肠道等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡,养殖生产上可选用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和酰胺醇类渔用抗生素进行防治。

中华绒螯蟹致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏特性

【目的】明确中华绒螯蟹黑鳃病的病原菌及其药敏特性,为该病的临床诊断和防控提供科学依据。【方法】采用传统方法从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定病原菌的致病性,利用API 20E细菌鉴定系统和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定,并以K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中共分离获得4株疑似病原菌株(C1、C2、C3和C4),人工回归感染试验结果表明,仅C1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡,死亡率达90%,且试验中华绒螯蟹出现黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症,与自然发病的症状基本一致。依据C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析结果,可确定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),其对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为2.85×105 CFU/mL。药敏试验结果表明,C1菌株对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星和恩诺沙星等9种抗生素高度敏感,对多粘菌素B中度敏感,对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素3种抗生素已产生耐药性(不敏感)。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病,且对中华绒螯蟹具有较强毒力,实际养殖生产中可选用新霉素、多西环素等渔用抗生素进行防治。

具群体感应抑制作用短小芽孢杆菌F3-1菌株的诱变育种

【目的】获得群体感应(QS)信号分子降解能力更强的突变短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),增强其在水产细菌性病害防治中的效果,为水产养殖业利用细菌QS淬灭机制防治细菌性疾病提供借鉴。【方法】以具有降解QS信号分子特性的短小芽孢杆菌F3-1为出发菌株、紫外线和亚硝酸钠(Na NO2)为诱变剂进行诱变选育;以紫色杆菌(Chromobacteria violaceum ATCC12472)为报告菌株筛选正向突变,经连续传代25代后测定其遗传稳定性;采用单因素试验测定培养时间、p H、盐度和温度对突变菌株降解QS信号分子能力的影响,同时通过扩增QS抑制基因aii A及SDS-PAGE分析验证突变菌株的蛋白表达情况。【结果】两种诱变方法共获得205株突变菌株,以紫色杆菌为报告菌株通过紫外诱变筛选出具有QS抑制作用的正向突变株4株,编号分别为FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。其中,突变菌株FF1-2的蛋白产量达47.48±2.87μg/m L,约是出发菌株F3-1的3.12倍,对紫色杆菌的褪色圈直径是出发菌株F3-1的2.96倍,抑制紫色素的能力较出发菌株F3-1提高64%,说明该突变菌株具有很强的QS抑制能力;连续传代25代后,突变菌株FF1-2的产蛋白能力及对紫色素的抑制作用无显著变化(P>0.05)。突变菌株FF1-2在培养时间为40 h、温度30℃、盐度0.5%、p H 7.0时,紫色素褪色效果最佳。从出发菌株F3-1和突变菌株FF1-2中均能扩增获得753 bp的aii A基因,且通过SDS-PAGE分析验证二者在28 k D处均呈现出特异条带。【结论】采用诱变育种技术筛选得到的突变菌株FF1-2能显著提高QS抑制能力,且该抑制能力能稳定遗传,即通过诱变育种技术提高短小芽孢杆菌的产酶量及酶活力具有可行性。

具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化

【目的】优化具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)T-1株的培养基及发酵条件,进一步提高其产孢量,为今后开发地衣芽孢杆菌制剂(抗菌益生菌)打下基础。【方法】在摇床发酵条件下,采用单因素试验筛选T-1株的最佳培养条件,并确定影响发酵菌液活菌含量的主要影响因素。根据Plackett-Burman试验结果,筛选出影响芽孢产量的2个最显著因素,以最陡爬坡试验确定其响应中心点和最佳浓度范围,然后通过Box-Behnken中心组合试验和响应面分析获得最佳发酵培养条件。【结果】T-1株的最适发酵培养条件为温度37℃、盐度0.5%和pH 6.0,在此条件下T-1株芽孢产量与培养时间呈正相关,在培养48~60 h期间其芽孢产量趋于稳定。在对T-1株芽孢产量影响较大的6个因子[X1(糖蜜)、X2(可溶性淀粉)、X3(酵母浸粉)、X4(CaCl2)、X5(摇床转速)和X6(接种量)]中,X2(可溶性淀粉)对T-1株芽孢产量的影响达显著水平(P<0.05),X5(摇床转速)的影响达极显著水平(P<0.01),其他因子的影响均不显著(P>0.05)。T-1株的最佳培养基为可溶性淀粉1.11%、酵母浸粉0.3%和CaCl20.5%,在摇床转速218 r/min的培养条件下,其芽孢产量较优化前采用初始基础培养基的芽孢产量提高6.25倍。【结论】具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株在优化后的发酵培养条件下,其芽孢产量较优化前明显提高,且延长菌株生长的稳定期,加上优化筛选出的培养基是采用相对廉价且高效的原材料,有效节约了生产发酵成本,可在规模化生产上推广应用。

低温条件下海水暂养装置脱氮系统的构建及其应用效果

【目的】设计一种可有效降低海水暂养循环系统中氮浓度的新型脱氮技术工艺,提高鲜活海产品的暂养存活率,以确保健康安全海产品的流通及满足人们的膳食需求。【方法】针对暂养水体温度低、碳氮比低及溶解氧高等特点,采用农业废弃物玉米芯作为碳源和生物膜载体,通过驯化低温脱氮菌(硝化菌和反硝化菌)并结合人工强化挂膜方式建立同步硝化反硝化脱氮系统。【结果】经低温、高盐驯化富集培养的硝化菌富集液和反硝化菌富集液均以变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主,但在纲水平上,硝化菌富集液中以γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)为主,其相对丰度分别为83.50%和12.90%,而在反硝化菌富集液中γ-变形菌纲为主要纲,其相对丰度为91.30%。通过电镜扫描发现,置于脱氮反应器内的玉米芯表层有微生物膜覆盖,其表层孔隙数量明显减少;玉米芯还作为固相碳源,促使反硝化过程持续进行。玉米芯脱氮反应器装置运行60 d内,出水口水样的总氮、氨氮和硝氮去除率均随时间推移呈先升高后降低的变化趋势,最高去除率分别达(63.46±0.55)%、(62.79±0.52)%和(65.00±0.63)%。【结论】以玉米芯为碳源和生物膜载体、利用人工强化挂膜构建的玉米芯脱氮反应器装置能同步实现硝化反硝化过程,脱氮效果佳且可保证系统长期运行,还具有构建工艺简单、体积小及成本低等特点,适用于大部分海产品低温暂养系统。

通过宏基因组学发现生物催化剂

现在大多数化学合成使用对环境有害的有机溶剂.如果用酶作为生物催化剂,则可在化学合成反应中少使用或不使用有机溶剂,所以使用酶作为催化剂更环保.随着宏基因组学的发展,以及二代测序成本的持续大幅度下降,基于宏基因组学获得生物催化剂已经成为最重要的方法.本文综述基于宏基因组学发现生物催化剂的各种方法,对目前世界上采用的各种筛选方法进行归纳,共总结出两大类方法:一是基于宏基因组文库的筛选方法,另一种是基于序列的遗传筛选方法.进一步对这两类方法细分为具体的7种筛选方法,并对各种方法的优缺点逐一进行回顾和评述.同时,对各种基于宏基因组学筛选生物催化剂的方法得到的结果进行统计分析,指出表型选择法筛选是采用最多的方法,有很大的实用价值.认为直接二代测序进行生物信息学筛选的方法也是有潜力的一种筛选方法,三代测序技术将在基于宏基因组学的生物催化剂筛选中发挥重要作用.(图2表8参92)

一株凡纳滨对虾源维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏特性

【目的】凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围内最主要的对虾养殖品种之一,2017年5-6月上海某凡纳滨对虾养殖场出现不明原因的死亡病例,发病急,死亡率高。从患病凡纳滨对虾体内分离到一株优势菌AVZ01,旨在确定病因并筛选出敏感药物,为今后凡纳滨对虾维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的防治提供参考。【方法】从患病凡纳滨对虾肝胰腺和肠道中分离致病菌,通过理化特性及16S r RNA基因序列分析进行鉴定,通过人工感染试验确定病原,使用Bliss法计算出半数致死剂量(LD50),并通过纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病凡纳滨对虾体内分离到一株优势菌AVZ01,进行人工回归感染试验后,对虾发病症状与自然发病症状相似,凡纳滨对虾的LD50为8.7×105 CFU/m L。根据该菌株的形态特征、理化特性、16S r RNA基因序列分析,综合判断该病原菌为维氏气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌株对米诺环素、诺氟沙星、庆大霉素等16种抗生素高度敏感,对青霉素、苯唑西林、头孢氨苄等9种抗生素耐药。【结论】分离菌株AVZ01对凡纳滨对虾有较强的致病性,养殖过程中可选用庆大霉素及新霉素等药物进行防控。