工业用油料植物脂肪酸及其改良

概述植物脂肪酸的工业用途以及工业用途脂肪酸类型和油菜工业用途脂肪酸改良的潜力和可能性。

抗ALS类除草剂作物种质创制与利用研究进展

农田杂草是影响作物品质和产量的主要因素,而化学除草是现代农业生产中杂草控制的主要手段。乙酰乳酸合酶(ALS,acetolactate synthase)也称乙酰羟基酸合酶(Acetohydroxyacid synthase),是植物支链氨基酸生物合成第一步的催化酶。ALS抑制剂类除草剂也称ALS类除草剂,其通过干扰ALS与底物结合来抑制植物支链氨基酸的生物合成,从而达到灭杀杂草的目的。随着ALS类除草剂在农业生产上的广泛应用,除草剂残留对后茬作物的伤害问题日益严重,对作物产量和品质的影响也尤为明显。因此,创制和培育ALS抑制剂类作物种质,是充分利用此类除草剂进行杂草防控的有效途径之一。通过化学诱变和自然突变的方法已在多种作物中创制出对ALS类除草剂具有抗性的种质,并成功培育出抗性品种。本文从ALS类除草剂的特性、种类和适用范围,抗ALS类除草剂作物的抗性机制,抗ALS类除草剂的作物种质创制和利用研究进展等方面进行了综述,以期为作物抗ALS类除草剂种质创新和品种选育提供参考,并对未来抗ALS类除草剂作物的可能发展作出简单预测。

植物环状RNA(circRNA)的形成及作用机制研究进展

环状RNA(Circular RNA,circRNA)是一类特殊的非编码RNA,其在生物体中广泛存在,是目前RNA领域最新的研究热点。本文通过详细对比分析动植物circRNA,综述植物circRNA的形成机制以及功能作用机理,为进一步深入研究植物circRNA提供基础。

油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9的遗传和基因克隆

【目的】分离和鉴定自然突变的油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体M9抗性基因,阐明抗性产生的分子基础。【方法】通过配置杂交组合研究其遗传规律,应用同源序列法克隆油菜ALS家族基因,采用杂交转育和小孢子培养技术将抗性基因转育到陆奥-五十铃细胞质雄性不育(MICMS)恢复系中,进行PCR鉴定。【结果】该突变体抗性由1个显性核基因控制。克隆获得BnALS1—BnALS3,核酸序列比对发现,M9抗性是由BnALS1的点突变使蛋白序列的第638位丝氨酸(AGT)残基被天冬酰胺酸(AAT)替代所致,将此抗性基因命名为BnALS1R。抗性基因BnALS1R转育到MICMS恢复系中的PCR检测表明,所有抗除草剂的恢复系都携带有BnALS1R。【结论】突变体M9抗性由1个显性核基因控制,BnALS1第638位丝氨酸突变成天冬酰胺酸是抗性产生的分子基础。

甘蓝型油菜高含油量种质选育研究

以种子含油量达到50%为主攻目标,自1998年以来采用品种间杂交和系统育种相结合的方法,以含油量起点较高的群体为选择对象,运用种子含油量的正向选择与种皮色泽负向选择相结合的筛选技术,育成了HOC1、HOC2和HOC3等3个种子含油量达到50%的甘蓝型油菜新种质。其年度间含油量性状较为稳定,综合性状良好。同时还比较了同一遗传背景下高、低油分品系角果皮与种子油分积累的差异,高含油量品系角果皮具有较强的油份积累与转移效率。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

甘蓝型油菜谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆和非生物胁迫下的表达

利用RT-PCR(reverse transcription PCR)技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆了一个非生物胁迫下细胞抵御活性氧(reactive oxygen species,ROS)伤害的关键酶GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)基因,命名为BnGPX1(GenBank登录号:HM130680)。BnGPX1的开放阅读框长度为711bp,推测编码蛋白含有236个氨基酸,分子量为26.10kD,等电点为9.37。BnGPX1酶具有GPX特有的3个结构域及半胱氨酸残基。通过PCR方法克隆得到BnGPX1基因组序列(GenBank登录号:HM130681)。该序列与拟南芥AtGPX1基因相似,由6个外显子和5个内含子组成,内含子的剪切位点符合真核生物GT-AG规则。半定量RT-PCR发现BnGPX1在油菜茎、叶、角果和花中表达量高,根中表达量较低。在盐、干旱和高温胁迫下BnGPX1表达量升高,出现峰值的时间不同。该基因对低温胁迫没有响应。

甘蓝型油菜无花瓣矮秆新种质APL03的选育

以正常四瓣双低甘蓝型油菜品系ZH004为母本、无花瓣种质APL01为父本杂交，对无花瓣及矮秆等性状进行多代定向选择，育成APL03新种质。该种质群体无花瓣株率迭100％，单株无花瓣度〉90％，植株高度130—140cm，单株有效角果数〉400个，种子含油率高达43％-47％，兼有抗倒伏、抗耐菌核病等特性，成为培育适于全程机械化作业栽培油菜新品种的基础材料。

人工海水胁迫下不同甘蓝型油菜品种发芽能力的差异

通过人工海水胁迫研究了不同甘蓝型油菜品种发芽能力的差异,结果表明:随海水盐度的增加,油菜种子萌发能力逐渐减弱;杂交油菜与常规油菜耐海水盐度能力相当,但中等盐度海水对杂交油菜的萌发抑制作用大于常规油菜;甘蓝型油菜品种种子萌发时耐海水盐度为1.31%,耐海水半致死盐度为1.70%,耐海水极限盐度为2.16%;甘蓝型油菜耐盐能力在品种间存在显著差异。

油菜乙酰乳酸合酶突变体S638N的酶学特性及其对ALS类除草剂的抗性

在对油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因Bn ALS1R克隆与功能验证基础上,为比较抗性基因编码的乙酰乳酸合酶突变体S638N酶学特性及其对ALS类除草剂抗性与野生型的差异,构建基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达S638N和野生型的重组融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析表明,S638N和野生型均能表达出约74 k D的特异性重组蛋白。纯化目的蛋白,在不同温度和pH条件下,测定S638N和野生型的酶活性。结果显示,温度和pH对突变酶活性的影响与野生型相同,表现为先升后降,在37℃、pH 7.0条件下催化活性均最高。同时,该突变酶的酶学动力学参数Km和Vmax与野生型没有显著差异,其对3个辅助因子的响应曲线也与野生型类似,缺少其中任何一个辅助因子均使突变酶S638N基本都没有活性。然而,突变酶S638N对IMI类除草剂抗性显著高于野生型,而对Su类除草剂敏感性和野生型相同。因此,突变酶S638N具有对IMI类除草剂的专一抗性,但未改变酶学反应特征。

我国抗ALS类除草剂油菜种质创制与研究进展

化学除草是控制田间草害的有效手段,但我国油菜化学除草面积非常有限。创制对特定除草剂具有选择抗性的油菜新种质,选育抗性品种是实现我国油菜化学除草的有效途径。乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS)类除草剂具有高效低量、选择性强、杀草谱广等优点,在生产上得到广泛应用。本文简述了ALS基因及其突变产生抗性的机制,着重介绍我国基于ALS靶酶突变的抗除草剂油菜种质创制、抗性生理生化和分子机理等方面的研究进展,并探讨了抗除草剂新种质在油菜抗性新品种选育、杂交油菜制种及抗性基因在转基因工程中的应用。

双低杂交油菜宁杂15号耐盐性鉴定

为鉴定双低杂交油菜宁杂15号的耐盐性强弱,研究了单盐与复盐对宁杂15号种子萌发及幼苗生长的影响。结果发现,在不同盐浓度胁迫下,宁杂15号的耐盐性强于秦油10号和宁杂11号;宁杂15号对复盐的耐受性强于对单盐的耐受性,在单盐浓度为1.05%以下时,宁杂15号发芽率可达到79%以上,幼苗株高和根长生长正常。在复盐浓度为1.4%以下时,宁杂15号发芽率可达到85%以上,幼苗株高和根长也正常生长。因此,宁杂15号耐盐性较强,适宜在江苏沿海滩涂大面积推广种植。

甘蓝型油菜谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及表达分析

为了解谷胱甘肽过氧化物酶基因在油菜抗非生物逆境中的作用,采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)宁油16号中克隆到谷胱甘肽过氧化物酶基因BnGPX2的cDNA全长序列644 bp,包括510 bp的开放阅读框,推测编码169个氨基酸残基,蛋白分子量为18 960,等电点为5.60。序列比对结果显示BnGPX2蛋白序列与拟南芥AtGPX2有较高的同源性(92.3%),具有植物GPX特有的3个典型结构域及Cys残基。通过常规PCR方法克隆到BnGPX2基因组序列1 782 bp,该基因由6个外显子和5个内含子组成,且所有内含子的剪切位点符合真核生物GT-AG规则。半定量RT-PCR法检测BnGPX2在油菜不同器官及非生物逆境下的表达,结果发现BnGPX2在根、茎、叶和花中表达量较高,角果中较低。在湿害和干旱胁迫下,BnGPX2表达量有所升高,但出现峰值的时间不同,而盐、高温和低温胁迫对BnGPX2表达量没有明显影响。

油菜乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的克隆及其重组蛋白质的原核表达

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因标记的开发与应用

草害已成为严重制约我国油菜生产的重要因素。种植抗除草剂品种和采用化学除草是防控草害的经济有效途径。为了开展分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)育种,加速抗除草剂品种培育,本研究针对已发现的抗咪唑啉酮类除草剂油菜M9中BnALS1R基因编码区第1913位点的SNP变异,开发高通量、低成本的竞争性等位基因特异PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)标记。采用筛选出的KBA1R19681913B标记在2个F2群体中进行KASP反应。结果表明,该标记能有效检测群体中存在的BnALS1R 3种基因型,其分离比均为1︰2︰1,遵循单基因遗传规律,且基因型与表型完全吻合。将该标记用于BnALS1R抗性纯合基因的回交转育,获得200多个抗咪唑啉酮油菜恢复系。该标记还可在油菜苗期鉴定抗性杂交种的纯度。KASP标记KBA1R19681913B的获得为油菜抗除草剂MAS育种以及抗性新种质的培育提供了技术支撑。

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的c DNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S::BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体p Czn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol·L^(-1)的IPTG诱导8h后,p Czn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67k D。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应p H值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55mmol·L^(-1)和6.40μmol·mg^(-1)·h^(-1)。

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含A/T区。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计的2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485 bp和405 bp预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达到0.1%。表明应用该技术可对W-4转基因事件进行特异性检测。

转基因甘蓝型油菜品系W-4高油酸性状遗传分析

为研究转基因甘蓝型油菜(Brassica napus L.)高油酸品系W-4的高油酸性状的遗传,用W-4(P1)及其野生型Westar(P2)为亲本,配置正反杂交组合,衍生获得F1、RF1、F2、RF2,B1、B2和RB1、RB2等世代群体。应用气相色谱定量分析方法,检测亲本及衍生世代群体成熟种子中油酸含量;同时,在苗期检测各个世代群体对卡那霉素(Kan)抗性的反应。结果显示:W-4种子中油酸平均含量为(85.10±0.73)%,Westar为(62.16±3.68)%;F1、RF1群体油酸平均含量分别为(77.55±1.30)%和(77.34±2.46)%,均表现为高油酸含量(≥69.5%),无细胞质效应;B1、RB1群体全部表现为高油酸(≥69.5%)。B2、RB2群体中,高油酸个体分别为55个和52个,低油酸个体分别为45个和48个,均呈1∶1分离(χ2=1.00,χ2=0.16);F2、RF2分离群体中,高油酸与低油酸个体呈3∶1分离(χ2=0.96,χ2=0.11)。表明,P1的高油酸性状受1对显性基因控制,呈孟德尔遗传,无细胞质遗传效应。此外,苗期Kan抗性检测结果表明,P1、F1、RF1、B1、RB1群体植株对Kan反应均表现为抗;P2对Kan反应表现为感;B2、RB2群体中抗、感植株呈1∶1分离,F2、RF2群体中抗、感植株呈3∶1分离。表明P1的卡那霉素抗性受1对显性基因控制。

甘蓝型油菜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter,NHX)基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因,油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法,获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA,含有一个长为1 629 bp的开放阅读框架,编码542个氨基酸,分子质量约59.9 ku。生物信息学分析表明,BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白,有12个跨膜区,是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现,BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHX1基因高度同源,表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。

油菜抗除草剂新种质PN19的交互抗性鉴定及其抗性基因的表达研究

鉴定抗除草剂油菜种质对不同种类除草剂的交互抗性,获得可安全交替使用的其他类型除草剂,可延长抗性品种使用时间。本研究以油菜抗SU类除草剂新种质PN19及转抗性基因的拟南芥和烟草为材料,在3-5叶期喷施不同浓度梯度的五大类ALS抑制类除草剂(SU、IMI、TP、PB和SCT类),通过抗性鉴定以确定PN19对各类除草剂的交互抗性。结果表明:SU和SCT类交互抗性最强,IMI和TP类其次,PB类最低。转基因植株除草剂抗性评价及烟草ALS酶体外活性分析表明,五类除草剂交互抗性功能源于靶标ALS酶对各除草剂敏感性下降。且五类除草剂处理后PN19抗性基因较野生型表达上调。本研究为田间ALS类除草剂混合使用进行杂草防控提供了可能性。