重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析

研究目的是分子设计并构建较G-CSF单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G-CSF/G-CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32/G-G和pET32/G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显著改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。

编码人B7-2胞外区cDNA的克隆、表达及生物活性鉴定

B7 2分子是共刺激信号系统B7/CD2 8/CTLA 4中的重要成员之一 ,为了更深入地探讨B7 2分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用 ,本研究通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人B7 2分子胞外区的cDNA ,测序后定向插入多个原核表达载体并诱导目的蛋白表达 ,用Western印迹和MTT鉴定生物活性。结果表明 :通过pGEX 4T 2载体实现了在宿主菌BL 2 1 (DE3) codenplus RIL中较高水平的表达 ,蛋白表达量为 2 0 %。经Western印迹和MTT鉴定 ,所表达及初步纯化的B7 2胞外区重组蛋白能与抗人B7 2单抗发生特异性结合 ;在抗人CD3单抗的协同下 ,B7 2胞外区重组蛋白能有效地促进外周血单核细胞的增殖。结论 :B7 2胞外区重组蛋白的获得为进一步研究B7

治疗类风湿性关节炎的新型免疫抑制剂阿贝西普的研究进展

以靶向炎性因子如肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）、IL-1、IL-6或其受体，为代表的新一代生物调节剂的研发成功和广泛应用极大提高了类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的治疗水平。然而这类药物常引起严重的毒副作用如严重感染和肿瘤的发生，况且还有大量的RA患者对该类药物并不敏感，因此寻找新的治疗途径和策略已成为目前RA研究的热点和焦点。T淋巴细胞在RA的发病机制中具有重要作用。一旦活化浸润滑膜的T淋巴细胞，

HLA-B*2704重链胞外功能区基因片段的克隆表达及其生物学功能的初步鉴定

目的:克隆及可溶性表达HLA-B*2704重链胞外功能区,并对其生物学功能进行初步鉴定。方法:以HLA-B位点全长cDNA为模板,用PCR-SSP方法扩增HLA-B*2704重链胞外区cDNA,经测序鉴定后与pET32a可溶性原核表达载体构建其重组原核表达系统,并在大肠杆菌BL21中表达,采用Western印迹及微量淋巴细胞毒阻断实验初步鉴定该蛋白的特异性及其生物学特性。结果:扩增出HLA-B*2704重链胞外功能区cDNA片段,构建的HLA-B*2704 cDNA-pET32a可溶性原核表达载体可在大肠杆菌BL21表达系统中得到较好表达,表达量约占菌体总蛋白的40%;通过Western印迹鉴定了表达蛋白的特异性;通过微量淋巴细胞毒阻断实验发现该重组蛋白具有生物活性并可特异性阻断HLA-B27阳性细胞的微量淋巴细胞毒反应。结论:在大肠杆菌中表达了具有生物学活性的HLA-B*2704重链胞外功能区,为强直性脊柱炎的机理研究及特异性阻断药物的筛选提供了实验基础和新的靶标。

强直性脊柱炎生物治疗的现状及新进展

强直性脊柱炎是一种以脊柱病变为主的慢性病,累及骶髂关节,引起脊柱强直和纤维化,造成不同程度的眼、肺、肌肉、骨骼病变,属自身免疫性疾病。强直性脊柱炎的致病机制仍未完全明了,但在治疗方面,生物治疗策略取得了可喜的新经验,生物药物展现出良好的应用前景。

中国北方汉族人群中HLA-B27基因多态性与强直性脊柱炎的关联研究

目的首次通过大宗病例对照研究来探讨HLA-B27基因多态性在中国北方汉族强直性脊柱炎(AS)患者以及健康对照人群中的分布情况并研究B27多态性与AS的关联性。方法选用602例北方汉族AS病例和694例健康无关对照进行病例对照研究。HLA-B27基因多态性分析采用序列特异引物介导的PCR反应(PCR-SSP)方法。关联性分析采用卡方检验。结果在AS患者及健康对照中分别有82.4%和7.5%的个体为B27阳性。关联分析证实B27与AS之间存在强相关性(OR=58,p=6.5×10-163)。本研究共发现5种B27基因多态性,B*2705、B*2704、B*2702、B*2707和B*2724,其中B*2704、B*2705和B*2702都与AS有强相关性,而B*2704的相关性最强(P=1.4×10-68),但是B*2705诱发AS的危险度却高于B*2704;B*2707和B*2724与AS则没有相关性。另外,北方汉族与上海、广东、台湾地区AS患者中B27基因多态性的分布有较大差异(其中B*2705差异最显著,P=6.28×10-52);而且4个地区人群中不同B27基因多态性诱发AS的风险度也有明显不同。结论本研究证实B27与AS之间存在高度相关性,并首次发现B*2704虽与北方汉族人群AS发病最为相关,但其诱发AS的相对危险度却低于B*2705。B27基因多态性在AS患者中的分布是存在地域差异的,这一现象提示不同地区汉族人群的AS在遗传学发病机制上是有其独特性的。

重组人干细胞因子在原核系统中高效表达的策略

目的 探索并建立人干细胞因子 (SCF)的原核高效表达系统。方法 设计特异性引物 ,以RT PCR从人胎肝组织中扩增出干细胞因子的膜外区活性片段 ,克隆进入pGEM T载体。以Goldkey软件进行翻译起始序列RNA结构和自由能优化 ;通过合成寡核苷酸和PCR技术将SCFcDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子 ;酶切连接构建多种原核表达载体并比较它们在宿主菌中诱导表达结果。表达产物经SDS PAGE、WesternBlot和MTT活性鉴定。结果 扩增SCF膜外区序列测定正确。构建的原核表达载体 pET32a(+) SCF在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,表达产量达 30 %以上 ,WesternBlot鉴定正确 ,初步纯化产物的活性与标准品相似。结论 根据使用的载体 /宿主系统 ,翻译起始序列 (TIS)的RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变对表达无影响 ;SCF基因在 5′端融合要比

HLA-B27分子及其与强直性脊柱炎关联的研究进展

HLA-B27是MHCⅠ类分子,因而具有MHCⅠ类分子的相关生物学特性。在正常免疫状态下,HLA-B27分子执行对内源性抗原如肿瘤及病毒的免疫监视及杀伤功能;但在机体免疫状态出现异常的情况下,它又可能成为引发自身免疫性疾病的主要相关因素,其中最为著名的是其与强制性脊柱炎(AS)的关联研究。我们首先概述了HLAB27分子正常免疫学功能的研究进展,然后对其在AS相关性研究中的进展进行了总结和分析。通过对上述两方面的综述与分析,全方位展示HLA-B27在执行免疫学功能和引发免疫病理性改变方面的作用,为全面认识和深入研究HLA-B27分子的生理与病理学作用提供坚实的基础。

L-型细菌蛋白表达系统

L-型细菌由于缺乏细胞壁以及具有的其它特殊生物学特性,通过连接合适的信号肽,可以用于许多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表达。表达产物在培养基中,表达的产量依赖于不同的基因序列、载体、宿主和诱导表达条件等因素。此外,L-型细菌还能将具有功能活性的蛋白展示在胞浆膜表面。

血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(TT)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pET32/TPO和pET32/TT,并在大肠杆菌中进行表达,以Westernblot鉴定表达产物;用生物信息学方法DSGene1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果成功构建TPO双体分子pET32/TT的原核表达载体,并经NcoI和NotI双酶切电泳及测序证实。通过转化origamiTM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40%以上;Westernblot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对TT双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,TT的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现β片层结构。结论本研究所构建表达的TPO单体和TT双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,TT双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型TT双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的表达优化及下游纯化

目的优化提高重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白在原核细胞中的表达量,并建立有效的下游纯化路线。方法对IL6D24-PE40KDEL的受体菌、菌体生长状态及诱导表达时间等进行优化,经反复筛选确定了高效简捷的纯化路线:即将Q型强离子交换树脂与DEAE弱离子交换树脂相结合的两步纯化法。结果宿主工程菌HB101的优化表达条件为2%接种量,30℃培养3h,42℃再诱导4h,可使目标蛋白的表达量由最初的13.5%提高到23.8%;经12%SDS-PAGE蛋白电泳证实,特异性表达产物为包涵体形式,占包涵体蛋白的40%,分子量约为60kD,与所预测的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白的分子量相吻合。两步纯化法可获得纯度>95%的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白,纯化蛋白的回收率为8.7%,经Western-blot实验证明,它可同PEA多抗和IL6单抗特异性的结合。MTT试验检测证实,该融合蛋白能特异性的杀伤高表达IL6R的U266多发性骨髓瘤细胞,ID50为180ng/ml;而对IL6R的T淋巴白血病细胞CEM则无杀伤,ID50>1000ng/ml。结论获得了高表达重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的菌株并建立了高效简捷的下游纯化路线,融合蛋白能特异性的杀伤表达IL6R的多发性骨髓瘤细胞系U266。

造血干细胞移植中供受体配型选择新标准──HLA分子模拟三维结构匹配

为了确定人类白细胞抗原 (HLA)三维结构配型的标准 ,总结出主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因 ,我们采用分子模拟技术模拟了HLA分子的三维结构 ,用计算机软件比较模拟结构间的差异大小。结果表明 ,HLA分子模拟结构间的差异不同 ,在大量统计分析基础上可以认为 ,HLA A和 B分子整体相对均方差 (relativemeansquaredeviation ,RMSD ,单位nm)大于 0 .0 4nm为差异显著 ,小于 0 .0 2nm为差异不显著 ;DRB1位点间RMSD大于 0 .0 2nm为差异显著 ,小于 0 .0 1nm为差异不显著 ,据此进一步总结了主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因情况。本研究提示 ,HLA三维结构配型是移植配型领域的新观点 ,值得进一步深入研究。

应用CREG,残基匹配和HLA三维结构选择不完全相合造血干细胞移植的供体

应用造血干细胞库进行检索后 ,往往有多个供体满足一定的检索条件 ,为了确定最适合的供体 ,选择了待进行移植的临床病例 ,分别从交叉反应组 (CREG)抗原、残基匹配理论和HLA抗原模拟三维结构比较等角度对各个供体进行了分析。结果表明 ,3种筛选方法的结果并不完全一致 ,但至少可以排除某些不适合的供体 ,进一步缩小选择范围。结论 :综合应用CREG、残基配型和三维结构比较方法 。

造血干细胞移植中HLA-Ⅱ类基因分型影响因素的探讨

目的：为了准确地进行造血干细胞移植供－受体的ＨＬＡ－Ⅱ类配型，对ＨＬＡ－Ⅱ类基因分型实验的影响因素进行了探讨。方法：采用美国莱姆达公司提供的微量ＳＳＰ＾ＴＭＨＬＡ－Ⅱ类ＰＣＲ－ＳＳＰ分型试剂盒对４００例造血干细胞移植供－受体进行基因分型。结果：采用０．５％ＥＤＴＡ抗凝的血标本与肝素抗凝的血标本相比，前者的护增效果好。ＤＮＡ终浓度为２５～２００ｎｇ／ｕｌ，最佳浓度为１００ｎｇ／ｕｌ。

HLA-B*2705重链的原核表达和活性鉴定

本研究探讨HLA-B*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLA-B*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEM-T载体,序列测定后构建原核融合表达载体pET32a(+)-B*2705,并转化大肠杆菌。Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外是否具有HLA-B27抗原活性。结果表明:HLA-B*2705重链融合蛋白在大肠杆菌中获得高效融合表达,表达产量占细菌总蛋白的50%以上;通过Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外具有HLA-B27抗原活性。结论:本研究获得了HLA-B*2705重链融合蛋白,为今后的相关研究打下了基础。

HLA分子三维结构与GVHD相关性研究

目的 进一步探索GVHD的发病机制，提高临床移植疗效。方法 HLA分型方法包括血清一细胞学、基因和基因亚型分型。血清一细胞学分型采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验和混合淋巴细胞培养；基因分型采用PCR-SSP方法．对基因亚型进行DNA测序，再进行HLA三维结构模拟。结果 (1)供一受体间HLA-Ⅰ、Ⅱ类血清学相合，组基因相合，基因亚型不同．但HLA三维结构模拟两者差别不明显，骨髓移植后仅发生了Ⅱ度GVHD；(2)供一受体间，基因亚型不同，两者仅差1个氨基酸，供一受体间抗原三维结构差别明显，骨髓移植后发生IV度GVHD；(3)受体为HLA-A°0201，供体为A°6801，二者血清学呈强交叉反应，其它位点均相合，移植后发生IV度GVHD，后经HLA三维结构模拟，两者差别明显。结论 当异基因骨髓移植供一受体问HLA基因亚型不同时，移植后GVHD的发生程度与HLA分子三维结构差别大小有密切关系；GVHD与抗原氨基酸差别的数量没有直接关系。

ERAP1基因多态性和HLA-B27相互作用与强直性脊柱炎关联的研究进展

HLA-B27阳性患者人群中,内质网氨基肽酶1(ERAP1)基因多态性与强直性脊柱炎(AS)密切相关。内质网中,ERAP1可有效剪切抗原肽,使其成为适合HLA-Ⅰ类分子提呈的寡肽。ERAP1基因多态性决定N端抗原肽修剪功能的正常与否以及HLA-B27分子的稳定表达。细胞水平的研究表明,不同ERAP1等位基因组合对于抗原肽底物的修剪能力决定了B27分子能否在细胞表面稳定表达。但是,功能型与功能异常型ERAP1如何影响HLA-B27抗原肽加工、B27稳定表达,以及如何影响AS疾病进程和免疫病理学改变等均未得到阐明。

PRDM9多态性与慢性粒细胞白血病的关联性研究

目的探究PRDM9多态性与慢性粒细胞白血病(CML)遗传易感性的关系。方法应用PCR直接测序技术与DNA单克隆测序技术,对116名Ph染色体及BCR-ABL融合基因阳性CML患者(CML组)和111名健康对照人群(对照组)的PRDM9多态性做DNA序列测定分析;对比CML患者与健康人群的PRDM9多态性分布差异,并通过卡方检验来探究二者之间的关联性。结果在对照组中共发现了7种PRDM9等位基因,其中已命名的有PRDM9-A、B、C、L3及L7,另外2个为新等位基因,分别命名为X1和X2。CML组中共发了10种PRDM9等位基因,除5个已命名等位基因与对照组一样,还发现了5个新等位基因X1、X2、X5、X12及X13。CML组与对照组中PRDM9-A及B等位基因分布为分别为68.10%vs 83.78%,19.40%vs 9.91%(P<0.01),AA基因型分布为41.38%vs 71.17%,AB基因型分布为33.62%vs 15.32%(P<0.01)。此外,PRDM9基因多态性分布在中国汉族与欧洲及非洲人群中存在明显差异(P<0.01)。结论 PRDM9多态性与CML具有关联性,A及AA是CML发生的保护等位基因及基因型,B及AB是CML发生的易感等位基因及基因型。PRDM9基因多态性分布具有人群特异性。

激活型KIR基因家族在allo-HSCT中的研究进展

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobalinlike receptor，KIR）是表达于自然杀伤细胞（nature killer cell，NK）及部分T细胞表面的一类受体。NK细胞的活化依赖于KIR介导的激活信号与抑制信号之间的平衡，当抑制型信号为主时。NK细胞就处于未活化状态，反之，则发生活化。

KIR多态性与异基因造血干细胞移植的研究进展

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（kiHercellimmunoglobulin—likereceptor，KIR）是主要表达于自然杀伤细胞（naturekiHerceil，NK）表面的一类糖蛋白受体，能够与细胞表面的HLA-I类分子特异性结合，调控NK细胞的功能。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后的并发症，如移植物抗宿主病（GvHD）、免疫排斥和移植后复发等，均是影响allo-HSCT治疗效果的主要因素。