云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。

侵染云南苹果的苹果褪绿叶斑病毒的RT-PCR检测和序列分析

以云南昭通、昆明、曲靖等地采集的苹果病毒病样品为试材,对其是否携带苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)进行RT-PCR检测,将本试验获得3个云南ACLSV分离物(ZT,ML,TJX)和GenBank上已登录的24个分离物进行序列比对分析。所有的ACLSV分离物的核苷酸序列相似性为81.3%～99.7%,它们可以被分成两大组群,组群A,包括了大部分不同寄主、地理来源的分离物,所有的ACLSV苹果分离物位于组A;组群B,包括了ACLSV全部的寄主为桃的分离物。本研究获得的3个苹果云南分离物属于组群A,组群A可分成两个亚组,其中,分离物ML和TJX位于同一个亚组,而分离物ZT位于另一个亚组。结果表明ACLSV苹果分离物与寄主种类存在一定的相关性,该研究为株系划分、分子流行和寄主抗性分析提供依据。

云南昭通苹果早期落叶病流行动态

苹果早期落叶病是影响苹果生产的重大病害,据报道苹果早期落叶病是褐斑病[Marssonina coronaria(Ell.et Davis)Davis]、斑点落叶病(Alternaria mali Roberts)、灰斑病(Phyllosticta pirinaSacc.)等多种病害的统称。通过在云南昭通系统调查影响苹果早期落叶病的主导因素品种及栽培模式,检测和统计病原菌种类及数量,调查早期落叶病发病率和病情指数,结果表明云南昭通苹果产区早期落叶病主要包括由M.coronaria引起的褐斑病和由A.mali引起的斑点落叶病,没有发现由P.pirina引起的灰斑病和其他病害。早期落叶病发病时间与品种关系密切,‘金帅’从5月下旬开始发病,8月初为发病高峰,9月底病害结束。‘红富士’则5月中旬开始发病,8月底达到发病高峰,10月底结束。不同品种和栽培方式对早期落叶病的发生程度有显著影响。

云南昭通苹果产区苹果花叶病毒的鉴定

研究通过电镜、免疫捕获RT-PCR的方法,对云南昭通表现花叶的苹果病样进行鉴定,电镜观察到直径为26～35 nm,无包膜二十面体的准等轴对称病毒颗粒,与苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)相似。根据苹果花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,提取病毒病样品总RNA,进行扩增、克隆和测序。序列分析表明侵染云南昭通的苹果花叶病病原为ApMV。把本试验鉴定的苹果花叶病毒与已报道的31个苹果花叶病毒分离物进行序列比对和分析。所有的ApMV分离物可以划为3个亚组。其中,亚组Ⅰ、亚组Ⅱ中均有侵染苹果的ApMV分离物。亚组Ⅰ寄主分化较多,亚组Ⅱ多为苹果分离物,而梨分离物单独聚在亚组III。本研究的云南昭通ApMV分离物(ZT)与昆明斗南月季分离物(Kmi2),美国分离物(NCGR9026)、捷克共和国分离物4个分离物(Cz1,Cz2,Cz3,Cz5)、德国分离物(G1)聚为寄主分化较多的亚组Ⅰ,与昆明斗南月季分离物Kmi2的核苷酸序列同源性最高,相似性达到99.8%。本研究为研究云南ApMV分子变异、与寄主的互作和指导防控提供依据。

云南苹果新品种抗斑点落叶病鉴定与评价

苹果斑点落叶病是引起苹果树早期落叶的主要病害,也是目前在我国苹果产区普遍发生、危害最严重的病害之一,推广和使用抗病品种是控制该病害的有效措施和方法。本研究系统调查了分布在云南的7个苹果品种红富士、新嘎啦、皇家嘎啦、斯维塔、短枝富士、金世纪和玉华富士的田间自然发病率和病情指数,同时进行室内人工接种鉴定。结合两种方法,对7种苹果新品种对斑点落叶病的抗性进行了评价。田间调查结果显示,其余6个品种的抗性均高于现在的主栽品种红富士,适合于在云南推广。室内抗性鉴定结果显示,红富士品种对斑点落叶病的抗性程度是7,其他苹果品种均为5,抗性表现型红富士品种为S(感病),其余品种均为MR(中抗)。本研究为苹果品种的推广使用提供了依据。

云南苹果树腐烂病菌分离株生物学特性和致病性研究

本研究采集分离获得云南昭通、丽江、曲靖马龙和昆明团结乡等苹果产区的苹果树腐烂病病斑上分离得到分离物,从中选取不同地点、在PDA培养基上不同性状的18个分离株作为研究对象,研究其培养性状。结果表明,18个云南分离株均为致病种Valsa.ceratosperma,种间各分离株在PDA培养基上的菌落颜色存在差异,其中易产孢的4个分离株为灰褐色菌落类群、8个分离株为黄褐色菌落类群、6个分离株为乳白色的菌落类群。所有分离株在0℃下都不能生长,在28~32℃生长良好。灰褐色和乳白色类群菌株耐高温,黄褐色类群菌株对高温低温的抵抗力较弱。提取各病原分离株DNA和进行PCR,r DNA-ITS序列,结果显示苹果树腐烂病菌的云南18个分离株的r DNA-ITS序列包含了2个单倍型,均为致病种V.ceratosperma。其中分离株NL-3、NL-4和NL-15的序列完全相同,为同一个序列型Ha1,其余15个分离株的序列完全相同为同一个序列型Ha2。比较云南分离物与其他分离物的相应序列,结果显示云南的18个分离株与山东淄博分离株（GQ865689）和日本分离株（AF192326）聚为一类,2分支,日本分离株独为1支,对应腐烂病菌V.ceratosperma,其余3个类群分别为V.malicola、V.mali和外群。r DNA-ITS序列分析结果显示云南分离物具有相似的遗传背景和来源。菌株致病性研究表明云南分离物菌株间致病力存在显著差异,黄褐色类群菌落的菌株的致病性较灰褐色菌落和乳白色菌落的类群的菌株强,而灰褐色菌落类型和乳白色菌落类型的致病性差异不明显。研究表明云南各地区大部分苹果树腐烂病的致病株均属于中国苹果树腐烂病菌的优势种类V.ceraterapema,其种内出现了明显的菌群分化和致病力分化现象。

危害云南丽江苹果的病虫害种类及其发生规律

丽江是云南重要的苹果老产区,病虫害连年发生,严重制约苹果产业的发展。为了及时有效地防治病虫害,在丽江市的玉龙、古城和宁蒗3个主产区,连续3年系统调查苹果病虫害的发生发展情况,找出了病虫害的发生种类及其规律。调查结果显示:病害种类有23种;其中,真菌性病害16种、病毒性病害3种、生理性病害4种。危害较重的有腐烂病、白粉病、褐斑病和斑点落叶病。腐烂病在玉龙、古城和宁蒗3个产区发病率存在明显差异,在宁蒗发病最为严重;褐斑病、斑点病和白粉病在3个产区差别不大。从季节动态看:腐烂病发病率相对稳定;白粉病发生高峰出现较早;斑点落叶病与褐斑病有着相近的动态规律。从年度动态来看:发病率基数存在差异,腐烂病、白粉病有逐年加重的发生趋势,褐斑病与斑点落叶病年份间波动较大。苹果害虫有28种,危害相对较重的有苹果棉蚜、苹果黄蚜和红蜘蛛等3种,在不同产区和不同年份之间存在细微差别和动态波动。该研究为云南丽江地区苹果产业发展和病虫害综合防控提供依据。