荧光标记复合PCR扩增微卫星位点的构建与优化

采用毛细管电泳技术,构建并优化了荧光标记复合PCR同时扩增多个微卫星位点。根据设计所扩增微卫星位点的期望长度,将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM(蓝色)标记,4个位点用HEX(绿色)标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用ABI3730xl毛细管电泳检测,以ROX500(红色)为长度标准物,结果经Genemapper3.5软件分析,检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物不仅精确读取微卫星位点的长度(分辨率高达1bp),还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的"回声斑";调整各微卫星位点引物比例使所有位点扩增强弱均匀。逐一检测复合PCR基本参数(dNTP浓度、PCR程序和模板DNA用量)对复合PCR产物的影响,优化PCR。结果表明通过毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性。