蛋白质组学及其在食用菌中的研究进展

近十几年来,随着人类全基因组测序工作的顺利完成,部分生物全基因组的测序也相继完成,生命科学研究随之步入后基因组时代。蛋白质组学(Proteomics)作为后基因组学的重要组成部分得到了快速发展,而食用菌蛋白质组学研究却相对较少,并且研究内容主要集中在差异蛋白质组学方面。本综述对蛋白质组学主要的研究内容和常用技术进行了简要的介绍,并对当前蛋白质组学技术在食用菌研究中的应用情况展开综述。最后对蛋白质组学技术在食用菌中的应用及开发前景进行了展望,为蛋白质组学在食用菌中的研究提供一定的理论参考依据。

草菇谷胱甘肽还原酶基因受低温影响的表达研究

谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）在真菌抵御逆境胁迫中起到重要作用,通过比对在草菇全基因组中获得编码gr的核苷酸序列。以对低温耐受性不同的草菇菌株V23（低温敏感型）和VH3（耐低温型）为试验材料,研究了低温胁迫对草菇菌丝gr的影响,并比较了该基因在V23和VH3中的表达差异。实时荧光定量PCR结果显示：在低温处理的最初2 h,低温敏感型菌株V23的gr相对表达量出现降低,到低温处理4～8 h时,其相对表达量分别上升至V23 0 h对照的1.78倍、1.05倍和1.36倍;耐低温型菌株VH3的gr相对表达量,在低温胁迫的最初2h时也呈现下降趋势,到低温处理4～6 h时,其相对表达量分别上升至VH3 0 h对照的1.47倍和1.41倍,但在低温处理8 h时,其相对表达量又降低至VH3 0 h对照的0.72倍。在正常生长和低温处理条件下,V23的gr相对表达量始终高于VH3,初步推测本试验中gr的高表达可能与草菇的耐低温能力无关。

杏鲍菇工厂化栽培主要原料理化特性的研究

对常用杏鲍菇工厂化栽培原材料的持水力,吸胀力,含氮量,酸败值等测定。结果表明:碳源原材料中,玉米芯的持水力为2.95,高于木屑与棉子壳。棉子壳含氮量明显高于木屑与玉米芯。麸皮、米糠、玉米粉和豆粕四种氮源原材料中,麸皮持水力有明显高于其他三种氮源,为3.03;玉米粉持水力最小,仅为0.97。豆粕含氮量显著高于其他三种氮源,含氮量为7.151%。所有检测原材料中,豆粕的吸胀力最大,为0.75。因此,提高培养料的保水性、弹性、含氮量应适当增加玉米芯、麸皮、豆粕的使用量。

美味牛肝菌全基因组SSR位点的分布规律研究

研究利用生物信息学方法对美味牛肝菌全基因组中的SSR位点进行了统计分析,并与其他3种担子菌基因组(灰盖鬼伞、裂褶菌、糙皮侧耳)进行了比较。结果表明,在美味牛肝菌基因组中存在2 732个SSR位点,SSR间的平均距离为17.1kb。73.02%的SSR位点分布在基因组中的非编码区,并以单核苷酸和三核苷酸重复类型为主。分布于5?或3?非编译区的SSR的相对丰度最高,为86个/Mb,而分布于编码序列的SSR相对丰度最低,为31个/Mb。同时,高通量筛选出41个长SSR位点设计引物并通过e-PCR进行了验证。最后通过与其他3种担子菌基因组相比,发现SSR数量与基因组大小无关,SSR类型都以短重复类型(单核苷酸至三核苷酸)为主,比较发现美味牛肝菌基因组中的SSR位点数量相对较多,密度也较高。

草菇VH3菌株及其单孢后代间的差异分析

从菌落形态、菌丝生长速度及RAPD分析等方面，研究草菇菌株VH3及其14个单孢菌株间的生长与遗传差异。研究结果显示，这些供试菌株的菌落形态、菌丝长势、菌丝生长速度存在较大差异；通过RAPD指纹分析，发现VH3及其单孢菌株的遗传相似系数在0.50~0.96之间，在基因水平上供试菌株间的遗传差异较大。草菇菌株VH3及其单孢后代的表型与基因型均存在显著性差异，表明VH3菌株借助有性生殖过程获得了丰富的生物学变异。

灵芝中真菌免疫调节蛋白LZ-8和LZ-9的比较分析

利用生物信息学方法从蛋白质基本理化特性、蛋白质三维结构以及蛋白表面电荷性质等方面,对灵芝中两种真菌免疫调节蛋白LZ-8和LZ-9进行了预测和比较分析。结果表明:LZ-9蛋白结构柔性较好,N端疏水性更强;利用同源建模构建的LZ-9三维结构模型具有稳定的空间立体结构。比较分析LZ-9与LZ-8蛋白表面静电势能,发现LZ-9中5个突变(R9G、K41Q、D45G、N58D和T89K)改变了蛋白表面静电性质,影响了LZ-9与细胞表面受体的结合,从而产生了与LZ-8不同的生物功能。

利用杂交方法选育香菇耐高温菌株

以香菇菌株808以及18N33和18N44为亲本,制备原生质体单核体和孢子单核体,并进行单单杂交和单双杂交,试验共设置杂交组合434对,通过显微镜镜检锁状联合及与亲本的拮抗试验获得235个杂交子。以47℃热激3 h后菌丝在PDA平板上的恢复情况作为初筛标准,71个杂交子表现出了较强的耐高温能力;以高温栽培出菇试验进行复筛,8个杂交子的综合农艺性状较优,是优良的耐高温杂交子。测定耐高温杂交子的纤维素酶活性和漆酶活性,并进行ISSR分析,结果表明,杂交子的纤维素酶活性与亲本具有显著性差异,大部分杂交子的漆酶活性与双亲或亲本之一具有显著性差异,杂交子与两亲本之间都存在着不同程度的遗传差异,是杂交子作为新菌株的有力证据。

高效草菇分子标记辅助杂交育种方法的建立与应用

【目的】建立一种高效草菇分子标记辅助杂交育种方法,并将其应用于选育低温高产草菇的单孢杂交中。【方法】通过出菇试验筛选获得高产草菇菌株,与低温出菇菌株VH3一同作为杂交亲本;采用交配型基因分子标记区分草菇单孢子的交配型,并完成杂交配对工作;最后结合快速筛选耐低温草菇菌种技术与杂交子真实性的鉴定方法,在栽培出菇试验前剔除部分不耐低温的草菇杂交子。【结果】出菇试验表明,屏优1号的生物转化率最高,用作杂交育种的高产亲本菌株。单孢杂交配对后,最初的496株草菇可能杂交菌株经初筛后,只剩余172株较耐低温的杂交菌株,使后期出菇试验的工作量减少了65%;杂交子出菇试验表明,在28°C出菇温度下,VV093杂交菌株的生物转化率显著高于两个亲本菌株,且农艺性状较好。【结论】建立了一种高效草菇分子标记辅助杂交育种的方法,包括亲本菌株的筛选、单孢交配型的区分、单孢杂交、杂交子的鉴定和筛选等,并在低温高产草菇单孢杂交育种中成功应用。

草菇锰过氧化物酶编码基因生物信息学分析及其转录水平和酶活性的测定

在草菇全基因组中发现了4个担子菌锰过氧化物酶MnP基因同源物(vv-mnp1、vv-mnp2、vv-mnp3和vv-mnp4)的基础上,对这4个MnP进行了生物信息学分析,并对其基因表达和酶活性进行测定。结果表明vv-mnp1与vv-mnp2基因结构相同,vv-mnp3与vv-mnp4基因结构相似。在4个草菇MnP基因启动子区域存在AP-2、cAMP、MRE、XRE和HSE等调控元件,预示着草菇中MnP基因的转录可能会受到氮源、碳源、重金属离子、芳香族化合物以及热击的影响。草菇MnP具有信号肽,不存在跨膜区域,表明其是分泌蛋白。草菇MnP中形成4个二硫键的8个半胱氨酸、潜在的锰离子和钙离子结合位点,在担子菌MnP中高度保守。系统进化树分析显示草菇MnP1和MnP2与香菇MnP1亲缘关系最近,而MnP3和MnP4与灰盖鬼伞过氧化物酶有较近的亲缘关系。RT-PCR检测到vv-mnp1、vv-mnp3与vv-mnp4能在含锰离子的培养基中表达,但运用锰离子氧化法没有检测到MnP活性,推测草菇中的MnP不具有将Mn2+氧化成Mn3+的能力。

草菇基因组中11个漆酶同源基因的生物信息学分析及铜离子对其表达的影响

通过分析草菇基因组中11个漆酶同源基因所编码的蛋白的性质、转录调控元件和测定铜离子存在条件下的草菇漆酶活性及11个漆酶基因的转录水平,揭示了草菇漆酶基因的各自特性、差异以及基因功能与进化机制。分析表明,这11个漆酶同源基因编码的蛋白具有508–562aa个氨基酸,分子量和理论等电点分别为56.25–60.75kDa和4.51–6.18(未经翻译后修饰),且都具有真菌漆酶铜离子结合区域的特征序列、4个能够结合催化底物的环形结构以及信号肽序列,都属于分泌性的胞外蛋白,但其底物结合位点数目、loop序列的一致性、跨膜区域数目和位置以及信号肽位置等存在较大差异。草菇11个漆酶起始密码子上游2 000bp的序列中含有真核生物的基本转录调控元件(TATA‐box,CAAT‐box及GC‐box)和多个潜在的调控元件(MRE、XRE、STRE、HSE、ARE、TRE、NIT元件等),但每个基因所含调控元件数目及种类各有不同。在液体培养条件下,铜离子能够诱导除vv‐lac2、vv‐lac3和vv‐lac7之外的其余8个草菇漆酶基因的表达,且适宜浓度的铜离子有助于草菇漆酶活性的增加。

变转速策略调控灵芝菌丝体发酵高产三萜

灵芝发酵过程中,采用变转速调控策略,对振荡发酵阶段进行优化,以期达到高产三萜的目的。振荡阶段最佳条件为转速由150r/min变为100r/min,该策略与液体静置培养相结合,最终菌丝体三萜产量高达678.0g/L,比优化前提高了21%。振荡发酵阶段的变转速策略有效地提高了三萜的产量。

热激处理对草菇耐冷性的影响及对hsp100基因的诱导

热激蛋白是生物体抵御逆境胁迫的重要蛋白,高温胁迫是诱导热激蛋白产生的重要因素,其中Hsp100蛋白可以在高温诱导时大量产生。本研究以草菇菌株V23和VH3为试验材料,首先观察了热激处理对低温胁迫后草菇菌丝恢复生长情况的影响,然后测定了热激处理再进行低温胁迫后草菇hsp100基因的表达量变化。研究结果显示:热激处理显著提高了草菇V23与VH3的恢复生长速度,增加了二者菌丝体中hsp100基因的表达量,有助于增强草菇对低温胁迫的耐受性。

草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析

木聚糖酶是半纤维素酶系的重要组成部分,能够分解水稻、小麦等农作物秸秆中的半纤维素。研究探讨木聚糖酶相关基因及其功能,为进一步探讨木聚糖酶与草菇生物转化率之间的关系提供理论依据。首先通过生物信息学手段构建了草菇2个木聚糖酶基因xyn1和xynII编码氨基酸序列的系统进化树,然后从生物转化率不同的草菇菌株分别提取各自的RNA,反转录为cDNA后,采用实时荧光定量PCR技术分析了xyn1和xynII基因的转录表达情况;最后应用DNS法对这些菌株中的木聚糖酶活性进行了测定。研究结果表明,xyn1编码的氨基酸序列与草腐菌相似性较高,而xynII编码的氨基酸序列与木腐菌遗传差异较小。在木聚糖酶活性测定和实时荧光定量PCR结果中,不同菌株的木聚糖酶活性趋势与xynII的转录表达趋势相似,均呈现依次递减。草菇的木聚糖酶活性与其生物转化率之间存在正相关性,推测草菇不同菌株木聚糖酶活性差异可能表现在转录水平上的差异。

香菇基因组中L-半胱氨酸亚砜裂解酶同源蛋白的生物信息学分析

L-半胱氨酸亚砜裂解酶(L-cysteine sulfoxide lyase,C-S lyase)是香菇中含硫风味物质生物合成途径的关键酶之一。本文基于6个不同香菇菌株的全基因组测序数据,挖掘了24个潜在的香菇L-半胱氨酸亚砜裂解酶(LentinulaedodesC-Slyase,Lecsl)同源基因,对其编码蛋白的生理生化特性、信号肽、跨膜结构域、转录活性、分子进化、保守基序和蛋白三级结构等方面进行了分析。结果发现,这24个香菇Lecsl同源蛋白含有相同的蛋白结构域(IPR015424和IPR000192),都属于L-半胱氨酸脱巯基酶家族(PTHR43092:SF2),都不含信号肽和跨膜结构,但它们的蛋白稳定性有所不同。对24个Lecsl同源蛋白进行聚类分析发现,其中的11个组成了新的进化分支,这一分支的Lecsl同源蛋白在香菇的菌丝体或子实体中有转录活性,且含有蒜酶和L-半胱氨酸脱硫酶的保守基序19,推测这一分支的Lecsl同源蛋白在香菇中具有催化产生含硫风味物质和内源性甲醛的活性。进一步分析发现,这一分支又分为两个亚支,其中一支包含已发现的Lecsl/LE01_CSL1,并且在香菇的菌丝体和子实体阶段都有转录活性;另一个亚支上的C-Slyase同源蛋白仅在菌丝体中有转录活性,推测这两个亚支的L-半胱氨酸亚砜裂解酶分别在香菇生长发育的不同阶段发挥催化作用。通过三维结构的解析,阐明了Lecsl中保守基序19亦是使蒜酶产生催化活性的关键结构域,并且利用分子动力学模拟的方法,预测保守基序19中的Asn3、Gln5和Ser6是香菇C-S lyase产生催化活性的关键氨基酸残基。

应用变色法筛选斑玉蕈优良杂交子

【目的】将变色检测方法应用于斑玉蕈优良杂交菌株的选育,缩短育种过程。【方法】采用分光光度计检测变色培养基的颜色变化,计算脱色率(D值)。【结果】变色检测培养基的颜色变化和脱色率(D值)是一致的,即培养基显示黄色时D值是正值,培养基显示蓝色时D值是负值。D值与斑玉蕈主要农艺性状具有紧密联系,D值是正值的菌株平均吃料速度比D值是负值的菌株快,单瓶产量和正常子实体数与D值呈正相关性,畸形菇数与D值呈负相关性。【结论】应用变色检测法可以快速简单地筛选出优良菌株,缩短斑玉蕈育种进程。

桑黄菌株活力评价及优良菌株筛选

通过对菌株生长活力、菌株抗氧化能力等多种生理生化指标的测定分析,对7个"桑黄"菌株进行了菌株活力评价,筛选出1株优良菌株SH1,该菌株的菌丝生长活力、发酵生物量、抗氧化能力均优于其他6个菌株。并且通过相关性分析,建立了一种有效评价桑黄生物量高产菌株的快速筛选方法。

草菇GH61家族基因的生物信息学分析及金属离子对其表达水平的影响

在前期工作中发现草菇含有30个GH61家族基因同源物(Vv_gh61_1至Vv_gh61_30),进一步分析了这些基因的结构特点以及其编码蛋白基本性质和系统进化关系,并研究了Cu^(2+)和Mn^(2+)对基因表达水平的影响。分析表明有17个草菇GH61基因串联成6个基因簇,存在明显的串联重复现象,系统发育树与基因外显子位置分析表明串联重复基因分布在同一进化分枝上并具有相似的基因结构,串联重复基因编码序列一致性在71%–94%之间。草菇GH61编码蛋白的氨基酸数目在217–442aa之间,分子量和等电点分别介于22.4–45.4k Da和5.2–9.3之间,绝大多数都含有信号肽并定位在细胞外,都含有Glyco_hydro_61功能域以及CBM1、peroxidase等多样化的功能域,系统进化树表明草菇GH61家族基因具有3个主要进化分枝,与灰盖鬼伞等的GH61基因有较近的进化关系。金属离子诱导作用显示,Mn2+对草菇GH61家族基因的表达水平存在诱导作用而Cu2+的诱导作用不明显。