“流域治理”审计的评价思路、组织方式和开展策略——以S公司为例

“流域治理”审计基于可持续性发展理念,追求企业盈利、社会责任、环境责任三者的和谐统一。本文探讨了在“投资主体一体化带动流域治理一体化”的流域治理模式中,S公司如何利用“微水审处理、中水审治理、大水审开发”的审计评价思路,以及“内外审、甲乙方、政与企”联动的协调审计模式开展“流域治理”的内部审计实践。

新型H7N9禽流感病毒NA蛋白胞外区片段的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

旨为以原核表达系统表达、纯化新型H7N9禽流感病毒(安徽株)NA蛋白胞外区片段并制备该蛋白的多克隆抗体。对新型H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白胞外区片段进行生物信息学分析,基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化并合成该蛋白编码基因。将构建的重组质粒pET28b-tN9(Truncated N9)转化至E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta和E.coli Arctic Express(DE3),进行诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定。选取E.coli BL21(DE3)重组菌进行放大培养、IPTG诱导并对诱导产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以Western blotting和间接ELISA法检测抗体特异性及效价。成功表达并纯化目标蛋白,Western blotting显示制备的多克隆抗体能特异性识别重组蛋白和新型H7N9禽流感病毒(上海株),间接ELISA方法检测制备的多克隆抗体,效价为1∶256000。利用原核表达系统高效表达并纯化了tN9蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,旨为深入探索NA蛋白结构及功能、H7N9禽流感病毒致病机制和建立快速检测方法奠定基础。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域蛋白的分泌表达及其免疫原性分析

目的原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARSCoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路。方法扩增SARS-CoV-2 RBD蛋白基因片段,酶切后与pNCMO2表达载体连接,构建重组表达质粒pNC-RBD。将重组原核表达质粒转化入短小芽孢杆菌感受态细胞,扩大培养并降温诱导蛋白表达。利用亲和层析纯化目的蛋白,经氢氧化铝佐剂吸附后经背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,以仅免疫铝佐剂为对照,每组10只。ELISA法检测体液免疫效果,体外增殖试验测定细胞免疫效果,ELISA法测定多种细胞因子的体外分泌,流式细胞术测定细胞分型。结果重组表达质粒pNC-RBD经菌落PCR及测序证明构建正确。重组蛋白相对分子质量约22000,可分泌表达。纯化后重组蛋白纯度达95%以上。免疫小鼠后血清结合抗体和中和抗体效价分别可达1∶10000和1:750左右,均显著高于佐剂组(t分别为2.845和2.528,P均<0.01);体外可刺激淋巴细胞增殖,并促进IL-1β及IFNγ的分泌;细胞分型试验结果表明促进了CD4~+和CD8~+T细胞淋巴细胞增殖。结论成功可溶性表达了SARS-CoV-2 RBD蛋白,其免疫原性良好,为以RBD蛋白为基础研制SARS-CoV-2基因工程疫苗奠定了基础。

吸附无细胞百白破联合疫苗的免疫原性及免疫持久性

目的 观察武汉生物制品研究所有限责任公司（以下简称武汉公司）吸附无细胞百白破联合疫苗（diphtheria,tetanus and acellular pertussis combined vaccine,DTaP）的免疫原性和免疫持久性。方法 于2007年9月在成都地区选择670名未接种过百白破联合疫苗,无百日咳、白喉、破伤风疾病史的足月出生的健康婴儿,按2：1比例随机接种3剂观察疫苗（武汉公司生产的DTaP）和对照疫苗（某厂家生产的DTaP）,进行基础免疫,每剂间隔1个月,2009年3月进行加强免疫,接种剂量均为0.5 ml/（剂.人）。基础免疫接种前和全程接种后30～50 d、加强免疫前和加强免疫后1个月、1、2、3年分别采集静脉血,分离血清,经ELISA法测定百日咳毒素抗体（pertussis toxin antibody,PT-Ab）、丝状凝集素抗体（filamentous hemagglutinin antibody,FHA-Ab）、白喉抗体（diphtheria antibody,D-Ab）、破伤风抗体（tetanus antibody,T-Ab）GMT,若免疫前抗体为阳性,则计算4倍增长率。结果 基础免疫试验组351例、对照组193例完成了全程接种,即544例受种者符合方案要求。DTaP基础免疫后,试验组与对照组的4种抗体阳转率及抗体4倍增长率差异均无统计学意义（P〉0.05）;试验组FHA-Ab GMT明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。加强免疫前,试验组与对照组4种抗体阳转率差异无统计学意义（P〉0.05）;加强免疫后1个月,试验组FHA-Ab阳转率明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;加强免疫后1、2、3年,试验组与对照组4种抗体阳转率和抗体GMT差异均无统计学意义（P〉0.05）;加强免疫后1年,4种抗体GMT均高于有效保护水平,加强免疫后2年,PT-Ab和FHA-Ab GMT已降至保护水平以下,加强免疫后3年,D-Ab、T-Ab GMT仍高于保护水平。结论武汉公司生产的DTaP具有较好的免疫原性和免疫持久性。

阳离子脂质体DOTAP作为乙肝疫苗佐剂的免疫增强效果

目的探讨阳离子脂质体DOTAP（2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵）作为乙肝疫苗佐剂的免疫增强效果。方法薄膜蒸发复水法制备DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗,检测其粒径、Zata电位、包封率;将BALB/c小鼠随机分为5组：DOTAP阳离子脂质体乙肝疫苗组（DOTAP佐剂组）、不加佐剂的乙肝疫苗组（HBS组）、乙肝疫苗加铝佐剂组（铝佐剂组）、乙肝疫苗加CPG-ODN佐剂组（CPG-ODN佐剂组）以及PBS对照组,免疫剂量分别为0.2、2μg/（只·0.1ml）,每个剂量10只小鼠,分别于0、28d经肌肉免疫,0、14、28、42d采血,分离血清,ELISA法检测血清中抗HBs特异性IgG抗体、亚型抗体（IgG1、IgG2a）滴度。结果制备的阳离子脂质体乙肝疫苗平均粒径200~300nm,粒径分布均匀,带正电荷,包封率在70%以上。DOTAP佐剂组血清IgG抗体水平明显高于HBS组,其中2μg剂量组差异有统计学意义（P〈0.05）;与铝佐剂组相比,两个剂量组差异均无统计学意义（P〉0.05）;0.2μg剂量组显著低于CPG-ODN佐剂组（P〈0.05）。DOTAP佐剂组可同时诱导高水平的IgG1、IgG2a型抗体,两个剂量组产生的IgG1型抗体水平均与铝佐剂组相当（P〉0.05）,但IgG2a型抗体滴度均明显高于铝佐剂组（P〈0.05）;两个剂量DOTAP佐剂组产生的IgG1、IgG2a型抗体水平与CpG-ODN佐剂组相比,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论DOTAP阳离子脂质体作为重组乙肝疫苗的佐剂具有良好的免疫增强效果,其对体液免疫的增强作用不劣于铝佐剂和CPG-ODN佐剂,DOTAP佐剂可同时诱导Th2细胞和Th1细胞介导的免疫应答。

吸附无细胞百白破联合疫苗的安全性

目的评价武汉生物制品研究所有限责任公司（简称武汉公司）生产的吸附无细胞百白破联合疫苗（DTaP）的安全性。方法选择成都市疾病预防控制中心（CDC）、西安市CDC对1331名3～6月龄未接种过百白破联合疫苗，无百日咳、白喉、破伤风疾病史的足月健康婴儿，采用多中心、随机、双盲、平行对照的原则，按2：1的比例随机接种观察疫苗（武汉公司生产的DTaP）或对照疫苗（对照组1：成都生物制品研究所有限责任公司生产的DTaP；对照组2：天坛生物制品有限责任公司生产的DTaP），按计划免疫规程注射3剂DTaP，进行基础免疫，每剂间隔1个月，成都市CDC在基础免疫首剂接种后16个月进行加强免疫，在征集期内进行安全性主动观察；在湖北省、湖南省等全国17省25个市县展武汉公司生产的DTaP大规模接种后异常反应观察。结果基础免疫后，观察组与对照组预期全身反应、Ⅱ级及Ⅱ级以上发热反应以及Ⅱ级以上局部反应发生率差异均无统计学意义（P〉0．05）；加强免疫后，观察组与对照组预期全身反应和局部反应发生率差异均无统计学意义（P〉0．05）；基础免疫和加强免疫后均未观察到非预期不良反应／事件。58120名婴幼儿接种武汉公司生产的DTaP后，异常反应发生率为292．5／10万。结论武汉生物制品研究所有限责任公司生产的DTaP具有良好的安全性。

Toll样受体激动剂在疫苗研发中的研究进展

固有免疫细胞具有抗感染和疾病防御作用.这方面的核心是通过建立广泛的特异性联系,即通过固有免疫细胞表达模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）来检测病原体相关模式和危险物相关模式.Toll样受体（TLR）是模式识别受体中研究的最为广泛的一种受体.因此,TLR的激活具有促进固有炎症因子的释放和诱导特异性免疫两种作用.充分利用TLR的特点,在疫苗设计中加入相应的TLR受体激动剂,可以加速疫苗的免疫应答,产生更持久的保护.

不同年龄人群接种甲型H1N1流感疫苗后1个月内抗体水平的变化

目的：探讨不同年龄人群接种单剂15μg无佐剂甲型H1 N1流行性感冒（流感）病毒裂解疫苗（pandemic A /H1N1 influenza vaccine， A/H1N1InfV）（甲流疫苗）后1个月之内的抗体水平变化规律，为免疫方案的制定提供依据。方法采用血凝抑制试验测定受种者的血凝抑制抗体，比较每一年龄组人群在甲流疫苗接种后3、7、14、30 d的甲流抗体几何平均滴度（ geometric mean titer ，GMT）及增长倍数（ geometric mean increase ， GMI）、阳转率、保护率。结果961人接种了甲流疫苗。其中3，～11岁组在接种甲流疫苗后14 d抗体水平达到高峰，但14、30 d的保护率95％可信区间下限达不到FDA的要求；12～60岁人群在14 d达到高峰，且GMI、阳转率、保护率达到EMEA和美国FDA标准；＞60岁人群在30 d达到高峰，且GMI、阳转率、保护率达到EMEA和美国FDA标准。结论接种1剂甲流疫苗后，12～60岁人群在接种后14 d、＞60岁人群在接种后30 d均能获得有效保护；而3～11岁免前阴性人群在第14、30天达不到FDA关于保护率95％可信区间下限≥70％的要求。