表达狂犬病病毒G蛋白嵌合型重组水疱性口炎病毒的构建及鉴定

目的以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV。方法将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,获得重组病毒。通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测RV G基因和G蛋白表达。将重组病毒在Vero细胞上传代培养,检测不同代次病毒滴度并绘制病毒生长曲线。结果成功获得了重组病毒VSV-RVG,RT-PCR结果表明重组病毒基因组中成功插入了RV G基因,免疫荧光法和Western blot可检测到RV G蛋白的表达。重组病毒连续传代5次,病毒滴度稳定在7.5~8.5 lgTCID_(50)/mL之间。结论成功构建了表达RV G蛋白的嵌合型重组VSV,重组病毒具有良好的遗传稳定性,为以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础。

重组腺病毒在无血清悬浮HEK293细胞上培养条件的优化

目的对无血清悬浮HEK293细胞培养表达狂犬病毒(rabies virus,RV)包膜糖蛋白(glycoprotien,G)的人腺病毒5型(adenovirus type 5,Ad5)重组病毒(Ad5-RVG)的条件进行优化。方法以Ad5-RVG感染无血清悬浮培养的HEK293细胞,通过检测病毒收获液的感染活性粒子和总病毒粒子,比较不同补加新鲜培养基比例、感染复数、感染细胞密度、病毒培养时间及病毒培养温度等培养条件下的病毒产量,以确定重组病毒的最佳培养条件。结果Ad5-RVG在无血清悬浮HEK293细胞上的最佳培养条件为:在1.5×106 ml﹣1的细胞密度下按感染复数10感染Ad5-RVG,并在病毒感染时补加≥50%293SFMⅡ新鲜培养基,于(36±1)℃、120 r/min培养44~56 h后收获病毒液。结论确定了Ad5-RVG在无血清悬浮HEK293细胞上的最佳培养条件,为Ad5-RVG的大规模培养提供了重要的研究基础和数据参考。