金黄色葡萄球菌锰转运蛋白C的原核表达及小鼠免疫评价

目的在原核系统中表达金黄色葡萄球菌(金葡菌)锰转运蛋白C(manganese transporter C,MntC),对其免疫原性进行分析,为筛选金葡菌疫苗候选抗原提供参考.方法合成MntC基因,克隆至pET-22b(+)载体,构建重组表达质粒pET-22b-mntc,转化至E.coli BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达,镍柱纯化.将纯化产物进行免疫印迹法鉴定,再采用分子排阻高效液相色谱法进行纯度分析.将铝佐剂吸附重组MntC免疫BALB/c小鼠作为实验组,将铝佐剂免疫BALB/c小鼠作为对照组.经ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平、中性粒细胞呼吸爆发试验检测小鼠血清特异性抗体功能,再用细胞因子试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中抗原特异性细胞因子水平.免疫后小鼠用致死剂量金葡菌49521菌株攻毒,观察小鼠存活情况.结果经双酶切及测序鉴定,重组表达质粒pET-22b-mntc构建正确.重组MntC相对分子质量约为34000,以可溶性形式表达,可与抗His单克隆抗体特异性结合,纯度大于95%.将铝佐剂吸附MntC免疫小鼠可诱导产生高滴度特异性IgG抗体;经MntC免疫的小鼠血清能明显增强中性粒细胞对49521菌株的呼吸爆发,实验组在60 min内发光值均值比对照组提高78%;实验组脾淋巴细胞培养上清液中抗原诱导的IFN-γ、IL-5和IL-17A浓度分别为对照组的5.8、9.9和62.8倍,均高于对照组且差异有统计学意义(t值分别为3.75、3.95和3.93,P值分别为0.004、0.003和0.003);MntC免疫小鼠后以致死剂量49521菌株攻毒,小鼠生存率从1/6提升至2/3.结论正确表达的重组MntC具有较好的免疫原性,可作为金葡菌疫苗的候选抗原组分.

金黄色葡萄球菌荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型的建立及评价

目的建立金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型,并对模型进行免疫攻毒保护性评价。方法金葡菌荚膜多糖型CP8国际标准株49525经37℃培养24 h,用PBS缓冲液稀释成不同浓度菌液,分组经腹腔注射感染BALB/c小鼠,观察小鼠发病症状,统计生存率及体重变化,确定每只小鼠的致死剂量及亚致死剂量;采集不同感染时间的小鼠血液及心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏,进行细菌定植量检测及主要脏器病理学检查。用CP8多糖-蛋白偶联物(实验组)及氢氧化铝佐剂(对照组)对建立的小鼠模型进行3次免疫攻毒保护性实验,统计小鼠存活率。结果经腹腔感染途径建立的小鼠模型,每只致死剂量为3.0×10^9 CFU,亚致死剂量为1.5×10^9 CFU。感染发病小鼠表现为翘毛弓背、耸肩及行动迟缓,生存率及体重随感染剂量增加明显下降,血液及心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏均有细菌定植,心脏、肾脏、肝脏主要脏器中可见明显细胞坏死和炎性细胞浸润。与对照组比较,实验组小鼠3次攻毒存活率差异均有统计学意义(P均<0.01),对小鼠的保护率分别为55.6%、50.0%和57.1%。结论成功建立金葡菌荚膜多糖型CP8菌小鼠全身感染模型,并可用于疫苗保护性评价,为进一步研究多抗原组分疫苗的有效性和安全性奠定了实验基础。

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440000)为主。试验组小鼠对495213次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。

金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性测定方法优化及初步应用

目的优化金黄色葡萄球菌α-毒素(α-toxin,AT)溶血活性测定方法,用于无毒突变AT(non-toxic mutant AT,mAT)特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。方法使用AT裂解兔红细胞,释放血红蛋白,通过分光光度法检测溶血活性,并对该方法中的孵育时间、兔红细胞终浓度、Triton X-100浓度进行优化,同时验证方法重复性。对mAT特异性血清抗体进行体外功能性评价,绘制AT溶血曲线,计算AT溶血率50%时的浓度,检测血清半数中和抗体滴度。结果AT溶血活性最适检测条件为:孵育时间90 min,兔红细胞终浓度为2%(V/V),Triton X-100浓度为0.25%。此条件下,分别加入mAT和含mAT的多价抗原血清抗体,对AT溶血活性均起到明显的抑制作用。AT溶血率50%时浓度为1.75μg/ml,变异系数3.75%。mAT和含mAT的多价抗原血清抗体的半数中和抗体滴度初步结果均为1∶64。结论优化的AT溶血活性检测方法重复性良好,且检测时间较短,可用于特异性血清抗体体外功能性评价和中和抗体滴度测定。