NF-κB受体激活因子配体在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性

目的在大肠杆菌中表达并纯化NF-κB受体激活因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL),并检测其生物学活性。方法 PCR扩增RANKL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-RANKL,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达和表达形式。表达产物经镍离子柱亲和层析、阴离子交换层析及阳离子交换层析进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot检测其反应原性,BCA试剂盒测定蛋白浓度,并经MTT法及RAW264.7细胞分化试验测定其生物学活性。结果重组表达质粒pET-28a-RANKL经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组RANKL蛋白相对分子质量约为20 000,部分以包涵体形式存在;经纯化后纯度可达98.8%,可与相应抗体反应形成特异条带,蛋白浓度为56.72μg/ml,体外活性试验显示,RANKL具有良好的生物学活性。结论成功原核表达了RANKL,纯化的重组RANKL具有生物学活性,为骨代谢调控机制的研究及相关药物的开发提供了材料。