全层析法在由低温乙醇法组分Ⅲ沉淀制备人纤维蛋白溶酶原中的应用

目的确定以低温乙醇工艺的组分Ⅲ沉淀(以下简称FⅢ-P)为原料,用全层析工艺制备人纤维蛋白溶酶原(plasminogen,Pg)(以下简称FⅢ-P工艺)的可行性。方法用溶解缓冲液以不同稀释倍数和搅拌时间溶解FⅢ-P沉淀,检测溶解物中Pg的效价和抗原浓度,确定FⅢ-P的溶解和澄清条件;对FⅢ-P的溶解物进行前处理和亲和层析的预实验,通过观察层析过程判断FⅢ-P原料对亲和层析进行是否有影响,通过检测过程样品的血浆蛋白抗原浓度和Pg效价并计算Pg抗原回收率来评估亲和层析能否达到纯化Pg的目的。进行2批FⅢ-P全层析工艺(Pg亲和层析+SP层析,以下简称FⅢ-P工艺)的逐级放大研究,计算Pg比活性、步骤及总回收率、每吨血浆Pg产出量,通过与以血浆为原料的全层析工艺(以下简称血浆工艺)的数据进行比较来评估FⅢ-P工艺制备Pg的可行性。结果FⅢ-P用溶解缓冲液稀释10倍,搅拌1 h,室温10000×g离心15 min,上清用筛网初滤后再用8/0.8μm滤器澄清,最后用0.45/0.2μm滤器过滤后上样。预实验显示,以澄清过滤为起点到Pg亲和层析,Pg活性和抗原的步骤回收率分别为39.51%和108.64%,亲和层析后Pg的抗原浓度提高31.16倍,活性提高11.39倍,达到亲和层析纯化Pg的效果。两批逐级放大FⅢ-P工艺结果显示FⅢ-P工艺从血浆到SP层析的Pg抗原和活性总回收率分别为(45.76±1.10)%和(24.15±0.59)%,与血浆工艺相比总计损失了约1/3的抗原和约2/3的活性;SP层析洗脱液的Pg比活性为(4.68±0.25)U/mg,约为血浆工艺的一半,但是达到>4 U/mg的企业内部标准。FⅢ-P工艺的每吨血浆Pg抗原产出量为血浆工艺的68.73%,每吨血浆Pg活性产出量为血浆工艺的29.82%,基本达到FⅢ-P废物利用的目的。结论用全层析工艺从FⅢ-P中制备Pg的技术路线可行。

人类细小病毒B19核酸检测方法的建立及方法学验证

目的建立人类细小病毒B19实时荧光定量PCR核酸检测方法,并对该方法进行系统的方法学验证。方法针对B19病毒3种基因型的高度保守区设计特异性引物和探针,建立B19定量扩增标准曲线。对该方法的准确度、精密度(重复性和中间精密度)、线性范围、定量限、检测限、特异性及防交叉污染,基因分型及抗干扰能力进行验证。结果当B19病毒定量参考品范围为2.0×10^(1)~1.0×10^(8)IU/mL时,实测值与理论值进行双对数回归分析,回归方程R^(2)≥0.98,线性范围相关性良好。定量限为20 IU/mL,检出率100%。检出限为10 IU/mL,检出率95.23%。针对B19病毒3种基因型标本均能有效检出。针对甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、人巨细胞病毒、戊型肝炎病毒、梅毒螺旋体7种非B19病原体血浆均为非反应性,种属特异性良好。同时在其他7种同时病原体存在时,弱阳性浓度为E3 IU/mL的阳性标本能够稳定检出,B19核酸检测方法不受干扰。当血红蛋白浓度为431 mg/dL,甘油三酯(1269浊度),非结合性胆红素浓度为20 mg/dL时,本方法针对以上3种常见血浆干扰物质均为非反应性。同时在3种常见血浆干扰物质存在时,弱阳性浓度为E3 IU/mL的阳性标本能够稳定检出,B19核酸检测方法不受干扰。S1(E5 IU/mL)、S2(E4 IU/mL)2个浓度水平标准物质检测值与靶值的偏差均≤±0.5 log值。阳性标本1(浓度水平E5 IU/mL)和阳性标本2(浓度水平E4 IU/mL)日内日间精密度确认和连续5d精密度确认的CV值均≤5%。结论本方法特异性强,灵敏度高,线性范围广,稳定可靠,准确度高,可用于原料血浆中人类细小病毒B19核酸检测。

追溯合格献浆员滚动采集较高效价水痘-带状疱疹病毒IgG血浆的可行性分析

目的通过筛选合格献浆员、确定较高效价水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)-IgG的维持时间并追溯合格献浆员的在库血浆,建立快速、高效的合格原料血浆采集方案,用于静脉注射水痘带状疱疹人免疫球蛋白[human varicella zoster immune globulin for intravenous administration,VZIG(IV)]的制备。方法随机抽取本公司辖属5个浆站的血浆留样,每个浆站随机抽取100份,用已经建立并验证的VZV-IgG定量ELISA检测VZV-IgG,筛选出VZV-IgG效价≥3.0000 IU/mL的合格血浆,并建立合格血浆对应的献浆员名单(编号202201);按照名单202201与2020年筛选的合格(以VZV-IgG效价≥1.5000 IU/mL为合格血浆标准)献浆员名单(编号2020),在本公司2022年12月尚未出库的血浆中找到名单中献浆员对应的所有未出库血浆,取小样检测VZV-IgG效价,2轮检测结果汇总,确定VZV-IgG效价稳定保持的时间,按照更新合格献浆员名单的同时滚动收集其对应的未出库血浆的流程建立合格血浆采集方案。按照该方案在本公司辖属另外8个浆站中筛选出更多合格献浆员(名单编号202202)和合格血浆。随机截取100份合格血浆留样进行混合,检测其VZV-IgG效价,确定原料血浆筛选标准是否合理;汇总1300份血浆的VZV-IgG效价检测结果,计算较高效价VZV-IgG在健康人群中的比例,进行部分成本核算。结果按照202201和2020合格献浆员名单共追溯到121份未出库的合格献浆员血浆,其中202001名单(48人)中仅有15名合格献浆员,在2022年未出库血浆中找到79份血浆,大部分献浆员超过2年后血浆中的抗体效价明显下降,仅有1名献浆员的血浆在2022年仍然合格;202201名单的8名合格献浆员中有7人对应的32份血浆保持较高效价VZV-IgG(最低效价>2.5000 IU/mL),保持时间最长为8个月;以同样的收浆标准检测其余8个浆站800份血浆获得15名合格献浆员(名单编号202202)。按照追溯合格献浆员滚动收集合格血浆的采集方案,本次1300份血浆初筛共获得合格献浆员23人,占比1.76%,获得对应的未出库的合格血浆152袋,其中15名为1年内连续献浆5次以上的献浆员,最长连续献浆时间达8个月。随机截取100份合格血浆的小样制备的合并血浆的VZV-IgG效价为5.5275 IU/mL,达到VZIG(IV)的投料标准(≥4.5000 IU/mL);用该方案采集合格的原料血浆预计减少血浆检测量约7336份,可以大幅缩小检测人群的范围,极大降低检测成本。结论采用追溯合格献浆员滚动采集较高效价VZV-IgG血浆的方案可用于小规模VZIG制备所需原料血浆的快速、高效采集。

静注人免疫球蛋白中抗补体活性物质基础的探索性研究

采用凝胶过滤色谱法分离多聚体、二聚体、单体成分,建立了C1q酶联免疫吸附试验(ELISA)法,并进行专属性、精密度及敏感性等方法学验证,测定和比较了不同批次产品中的抗补体活性物质。结果显示,当酶标板C1q包被浓度为2μg/m L、二抗稀释倍数为3万倍时,供试品在1~50000μg/m L时呈典型的S型结合曲线,线性区间为10~400μg/m L。该方法的专属性、敏感性良好,精密度试验RSD(n=6)为6.7%。多聚体与补体分子C1q的结合显著高于二聚体和多聚体。多聚体是本品抑制补体活性的物质基础,可采用C1q ELISA法直接比较不同产品中的抗补体活性物质高低。

全层析工艺制备10%静脉注射用水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的质量控制

目的用全层析工艺制备10%静脉注射人水痘-带状疱疹免疫球蛋白[human varicella zoster immune globulin for intravenous administration,VZIG(IV)],对其纯化过程的关键步骤进行质量控制(包括IgG相对纯度、抗原回收率、杂质去除情况及半成品检定)。方法取100袋含高效价水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV-IgG),ELISA效价>1.500 IU/mL的原料血浆融化后制备约50 L合并血浆,按照全层析工艺进行10%VZIG(IV)的制备,对其关键步骤样品用免疫比浊法进行特定血浆蛋白的蛋白含量检测,计算目标组分中各种蛋白的占比、IgG步骤回收率和工艺总回收率;用BCA法进行总蛋白含量检测,计算IgG相对纯度;对合并血浆和半成品按照《中华人民共和国药典》2020版(三部)(简称《中国药典》)要求进行关键项目(蛋白含量、分子大小分布、纯度、抗A抗B血凝素、激肽释放酶原激活剂)检测,同时增加半成品的辛酸钠、IgG亚类、IgA、IgM、ALB的蛋白含量检测,合并血浆及半成品的VZV-IgG的ELISA效价检测。结果全层析工艺中A50吸附主要去除的是CER、FNC、C1I,去除率分别是39.321%、46.407%、74.132%;IgG步骤回收率为97.44%,相对纯度为15.17%。亲和层析主要去除了血浆中大部分杂蛋白,其洗脱液中主要成分为IgG和FIB(占比分别为69.891%和17.994%),其他蛋白占比均<5%,IgG的步骤回收率为69.47%,相对纯度为63.86%。辛酸盐沉淀主要去除了上一步残留的大部分杂质蛋白,仅有微量IgM(占比0.607%)和ALB(占比0.229%)残留,IgG的步骤回收率为81.00%,相对纯度为98.98%。DEAE离子交换层析主要去除的是IgM,IgG的步骤回收率为95.69%,相对纯度为95.01%。半成品的相对纯度为98.79%,整个工艺IgG的总回收率达到46.26%。全层析工艺将原料血浆的VZV-IgG的ELISA效价提高了18.33倍,抗原浓度浓缩了10.8倍,比活性从0.047 IU/mg提高到0.533 IU/mg。半成品各项关键指标检测合格,辛酸钠残留量<8.3 mg/L,IgA、IgM和ALB的残留量分别为21.500、0.609、57.500 mg/L,IgG亚类分布分别为:68.550、29.000、5.085、3.840 g/L。结论用全层析工艺制备的10%VZIG(IV),关键指标均符合《中国药典》和《欧洲药典》11.0版的要求。

静注人免疫球蛋白(pH 4)成品中人类免疫缺陷病毒检测(ELISA法)pH条件的摸索

目的 对静注人免疫球蛋白(pH 4)[human immunoglobulin(pH 4)for intravenous injection,IVIG,简称静丙]成品中人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)检测(ELISA法)的pH条件进行摸索,以期控制静丙HIV的残余风险,保证血液制品的安全性。方法 使用不同pH缓冲液稀释HIV抗体标准物质及抗原标准物质至检测限水平,观察试剂盒对不同pH、检测限水平HIV标准物质的检出情况,进而得出试剂盒适宜pH检出范围。使用不同浓度的Tris-HCl溶液调节静丙成品至试剂盒适宜pH范围,然后稀释HIV抗体标准物质及抗原标准物质至检测限水平,获得静丙适宜的pH检出范围。结果 HIV抗体标准物质和HIV抗原标准物质检测缓冲液pH 7.0~9.0组的A450/630值与生理盐水(NS)组相近,所用HIV试剂盒适宜pH范围为7.0~9.0。0.1 mol/L Tris-HCl溶液稀释静丙4.0至试剂盒适宜pH范围作为稀释液,抗体0.25 NCU/mL水平在静丙pH 7.0~8.0组检测A450/630值高于cutoff值,且明显高于静丙pH 4.0组,0.1 mol/L Tris-HCl溶液加入量占静丙体积1/5以上。1 mol/L Tris-HCl溶液稀释静丙4.0至试剂盒适宜pH范围作为稀释液,抗体0.25 NCU/mL和抗原1.5 U/mL水平在静丙pH 7.0~9.0组检测A450/630值高于cutoff值,1 mol/L Tris-HCl溶液加入量仅为检测总体积的1/28~1/37,对待检样品的有效检测含量几乎不产生影响。结论 相较于pH 4.0的检测条件,pH 7.5~8.0更适用于静丙的HIV检测。确定采用1 mol/L Tris-HCl溶液调节静丙pH至7.5~8.0用于静丙HIV检测(ELISA法)。有效解决了静丙成品pH偏酸不利于HIV检出的问题,同时未对静丙成品的检测体积产生影响,显著提升了检测结果的准确性和可靠性。