AcAPc2自剪切融合蛋白表达载体pTWIN1-AcAPc2的构建和表达

为表达和获取具有抗凝血功能的犬钩虫抗凝血肽(A cAP c2),采用搭桥PCR方法合成犬钩虫抗凝血肽全长双链cDNA序列,A cAP c2 cDNA全序列连入表达载体pTW IN 1上构建成具有蛋白自剪切功能的表达载体pTW IN 1-A cAP c2,将阳性重组子转入表达型大肠杆菌E.coli ER 2566进行表达。表达的融合蛋白A cAP c2-in te in2-CBD为可溶性蛋白,且融合蛋白约占菌体总蛋白的30.1%,经蛋白质印迹分析确定表达产物是具有CBD蛋白的特异性融合蛋白。融合蛋白A cAP c2-in te in2-CBD经几丁质柱高效亲和纯化,并经β-巯基乙醇诱导的独特的在柱自剪切后,得到目的蛋白A cAP c2,经SDS-PAGE分析在21 KD处呈现目的条带,所得的可溶性A cAP c2分子量符合其天然活性的二聚体形式。对A cAP c2表达和纯化工艺上的改进,方便了A cAP c2的获取,A cAP c2氨基酸序列的生物信息学分析初步阐明了A cAP c2的结构和功能的关系,为进一步研究A cAP c2的抗凝血机制及其作为抗凝血药的临床应用奠定了基础。