AAV载体介导的视网膜基因转移实验研究

目的 以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)作为标记基因 ,观察腺相关病毒 (AAV )载体介导视网膜基因转移作用 ,为视网膜疾病的基因治疗打下基础。方法 制备重组腺相关病毒 r AAV- gfp;将纯化的 r AAV- gfp病毒 10 μL (10× 10 1 2 TU· L- 1 )分别注射于青紫兰灰兔及日本大耳白兔视网膜下 ,于一定时间内取眼球或用眼底照相机进行观察。结果 注射 r AAV- gfp后未见兔眼术后细菌感染及明显免疫反应 ,在荧光显微镜下观察 GFP表达情况 ,3周时可见明显的绿色荧光分布于 RPE细胞层 ,5、6周荧光强度比3周增强 ,荧光范围也有所扩大。直至 10周荧光范围进一步扩大 ,强度更强。眼底照相机观察显示 ,最早 4周观察到眼底 GFP表达 ,至 7个月 (观察仍在继续 )仍然维持在高水平。结论 视网膜下注射 r AAV- gfp病毒可在 RPE细胞内稳定表达报告基因 gfp;AAV载体可望用于视网膜疾病的基因治疗。

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮα１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体ｐＢＶ３２２，使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体，达到１６×１０８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ，ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮα１ｂ，获得了电泳纯产品，其比活性为２×１０７ｕ／ｍｇ，分子量为１９ｋＤａ。此外，用ｐＡＴ１５３代替ｐＢＶ３２２，构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体。

中和性流行性感冒病毒基因工程抗体在昆虫细胞中的全基因表达、纯化及鉴定

将中和性流行性感冒 (流感 )病毒基因工程抗体IV 2、IV 6的轻链和重链Fd段基因 ,分别克隆入全抗体表达载体 pAC L Fc ,构建成杆状病毒表达载体pAC L Fc Ⅳ 2和 pAC L Fc Ⅳ 6 ,转染昆虫Sf9细胞 ,利用杆状病毒 /昆虫细胞系统实现抗体的分泌型表达 ,表达产物进行亲和层析分离纯化。SDS PAGE电泳和Westernblot法证实有完整免疫球蛋白的表达 ,免疫印迹法证实它们能与流感病毒血凝素蛋白特异性结合。经间接竞争性抑制ELISA法测定 ,抗体与流感病毒抗原结合的解离常数KD 值分别为 2 5× 10 -9M和 3 0× 10 -9M。流感病毒基因工程全抗体经在昆虫细胞中的表达、纯化和抗体特性鉴定 ,获得了两株纯化的全抗体 ,可用于以后的动物模型呼吸道粘膜被动免疫抗感染的研究。

抗虫植物基因工程研究进展

虫害是造成农业减产的主要原因之一。据不完全统计,全世界每年因虫害引起的作物减产达总产量的15％,损失高达数千亿美元。在我国,因虫害水稻减产在lO％以上;小麦减产近20％;

植物耐旱基因工程研究进展

随着生物技术的发展 ,特别是基因工程技术的迅速发展 ,植物耐旱已从传统的植物生理研究转向分子方向 .目前植物耐旱研究的分子生物学方法主要是基因工程技术 ,包括植物耐旱相关基因的克隆 ,植物水胁迫代谢调节相关基因的分离、鉴定 ,以及通过植物遗传转化改变植物遗传性状———获得稳定的耐旱植株 ,进一步推广生产 .利用植物基因工程技术获得稳定耐旱植株 ,对于干旱地区的农业、生态环境、畜牧业以及城市绿地的改造来说可能又将引起一场新的绿色革命 .

马立克氏病病毒基因结构与功能及其基因工程重组疫苗的研究现状

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ，ＭＤＶ）主要侵害鸡的性腺、神经、肌肉、皮肤、虹膜及各内脏器官，引起单个或多个组织器官的淋巴细胞增生和单核细胞浸润，是对养鸡业危害最为严重的传染病病原之一。该病最初由匈牙利病理学家Ｊ．ＭａｒｅＫ报...

重组腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因预防和治疗B16黑素瘤的实验研究

目的：研究重组腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因（rAAV—AG）对B16F0恶性黑素瘤细胞生长的影响。方法：观察rAAV-AG单次肌肉注射在预防肿瘤生长、血行转移及治疗肿瘤方面的不同作用；Western blot法定性检测血管抑素表达情况；免疫组化法检测肿瘤组织中的微血管密度（MVD）；TUNEL法检测肿瘤凋亡细胞数。结果：rAAV-AG单次肌肉注射后第2周至实验结束时（～70d）小鼠体内均有血管抑素表达；预防肿瘤生长抑瘤率为97％（P〈0．01）；预防肝、肺转移抑瘤率分别为37．5%（P＜0．05）和47．7％（P＜0．01）；低、中、高剂量组治疗肿瘤抑瘤率分别为44％、61％和65％，小鼠中位生存时间分别为58d、66d和68d，与生理盐水组比较，低剂量组无显著性差异（P=0．06），中、高剂量组均有显著性差异（P〈0．01）；基因治疗备组肿瘤MVD减少，凋亡细胞数增加，与生理盐水组比较，统计结果与各组抑瘤率一致。结论：rAAV-AG单次肌肉注射能有效预防和治疗B16恶性黑素瘤的生长及血行转移，延长荷瘤小鼠的生存期；在一定剂量范围内其抑瘤效应呈剂量依赖性；抑瘤作用可能是通过抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。

基因工程产品的N末端均一性及其中残留的痕量杂质蛋白的分析

利用Edman降解法,辅之以邻苯二甲醛阻断等技术,在蛋白/多肽测序仪-PTH氨基酸分析仪上微量自动测定了在大肠杆菌系统获得高效表达的重组人γ干扰素、α 2干扰素和白细胞介素-2等多种基因工程产品的N末端氨基酸序列。根据氨基酸色谱分析的原始资料,对上述蛋白质样品的N末端均一性进行了细致分析。在此基础上,借助序列库检索比较等计算机方法检定了这些样品中可能残留的痕量杂质蛋白,并对分析痕量残留蛋白的一般方法进行了讨论。分析结果表明重组人γ干扰素N末端均一;而α 2干扰素和白细胞介素-2的N末端不均一,其中主要含大致等量的N末端带有蛋氨酸与不带蛋氨酸的两种分子,仅在个别送检样品中发现痕量N末端丢失一个氨基酸的分子。通过在序列库中检索所测出的一段八肽疑似序列,推断在一批送检样品中含有痕量的卵清溶菌酶,经进一步纯化样品并测序后得以证实。本文结果为进一步优化和确定有关产品的生产流程并建立产品质量控制的标准提供了重要依据。

植物基因工程的现状与展望

介绍了80年代以来植物基因工程的历史、现状和发展趋势,对利用转基因植物生产药用蛋白,用工程病毒为载体生产药用蛋白,改进植物品质及逆境适应性,提高光合作用和固氮效率,抗除草剂工程植物及工程微生物与生物医学的关系等作了可行性分析和前景预测。

一种人新型基因工程干扰素rh-IFNα-m的高效表达、纯化和活性检测

为实现干扰素 (IFNα m)的高表达与纯化 ,研究其抗病毒、抗增殖活性。应用PCR技术将已构建的IFNα m的高表达基因亚克隆到原核表达载体pBV2 2 0上 ,构建表达质粒 pBV2 2 0 /IFNα m ,转化大肠杆菌DH5α进行表达。表达产物经初步检定以包涵体形式存在 ,包涵体进行变性、复性 ,然后经CM Sepharose FF、DEAE Sepharose FF离子交换层析和Sephacryal HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的干扰素IFNα m。以IFNα 1b为对照 ,在VSV Wish系统上采用细胞病变抑制法 ,测定纯品IFNα m的抗病毒活性。在Hela细胞上用MTT法进行抗增殖实验。结果表明包涵体含量占菌体总蛋白 4 0 % ,纯化的目的蛋白IFNα m纯度在 95 % ,比活高达 1 2 6× 10 7IU/mg ,纯化收率34 4 % ,IFNα m抗病毒活性和IFNα 1b相当 (P >0 0 5 ) ,抗增殖活性高于IFNα 1b(P <0 0 1)。

现代植物基因工程的挑战与希望

自从70年代末首次从分子水平上证实了有一种细菌,即土壤农杆菌(Agrobacterium tu-mefaciens)在侵染植物细胞后,不但能将它的一段DNA插入到被侵染的细胞的基因组中,而且还能稳定地随着植物遗传给后代。植物基因工程的发展日新月异,连续取得了一系列重大的突破,特别是进入80年代中后期,人们利用植物基因工程在植物抗病、抗虫、抗除草剂。

植物基因工程的研究及发展趋势(书面)

生物技术是10多年来迅速发展起来的高技术、新技术,具有十分明显的社会效益和经济效益。在所有的生物技术领域中,农业生物技术、特别是有关作物生物技术的研究和发展被认为是最有现实意义的技术之一,将在下一世纪出现的“绿色革命”中发挥巨大的作用。农业生物技术研究的内容有植物基因的操作,植物细胞和植物组织的培养,转基因植物和转基因鱼类、家畜家禽的获得等。农作物生物技术方面主要研究方向是提高蛋白质含量,改良氨基酸组成,提高作物抗逆境、细菌。

GM-CSF基因瘤苗抗肿瘤活性的实验研究

转细胞因子基因的肿瘤细胞疫苗是当今肿瘤免疫－基因治疗研究的热点。本文用逆转录病毒载体将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因转入大鼠Ｗａｌｋｅｒ瘤细胞株ＷＲＣ２５６，经Ｘ－射线灭活制备肿瘤疫苗。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测证实。ＧＭ－ＣＳＦ基因已成功地导入ＷＲＣ２５６细胞。生物学活性检测表明，灭活前后的转基因瘤细胞均能持续分泌ＧＭ－ＣＳＦ。动物试验结果表明，转基因瘤苗具有明显的抗肿瘤活性。并能诱导具有杀死瘤细胞功能的特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）。本工作对细胞因子基因瘤苗的研究及临床应用将具有重要意义。

全基因组扩增策略在基因芯片分析SARS冠状病毒实验中的应用

针对SARS冠状病毒的分子生物学检测是控制SARS流行的关键环节。为评价全基因组扩增对SARS微量样本检测的影响 ,采用 6 mer随机引物反转录 ,用加接头的随机引物合成第二链 ,再以接头序列为引物扩增并掺入荧光标记 ,最后与带有 70 mer探针的基因芯片杂交。此非特异方法基本覆盖了样本中的全部DNA ,结果发现SARS冠状病毒全基因组的扩增效果对基因芯片杂交结果的均匀性有较大影响 ,PCR循环次数增多会导致扩增均匀性的降低。分析了不同的引物对全基因组扩增均匀性的影响 ,探讨了全基因组扩增策略的缺陷。

三种血清学方法和qPCR方法在鸡滑液囊支原体检测中的综合应用研究

为评价不同方法对鸡滑液囊支原体(MS)活疫苗免疫和非免疫状态鸡群的监测效果,研究分别采用HI、SPA与ELISA三种抗体检测方法和qPCR方法同步对某养殖场A、B和C三组鸡群进行MS感染和抗体水平监测,其中A鸡群23日龄免疫MS活疫苗(MS-H株),B、C鸡群不免疫MS疫苗。结果显示:三种血清学检测方法所测MS抗体阳性率趋势基本一致,HI抗体效价变化规律和ELISA抗体效价变化规律相似,但血清学方法相对于qPCR方法具有一定的滞后性,qPCR可以最早发现MS野毒感染,且在使用活疫苗免疫的情况下对疫苗和野毒进行鉴别检测。研究提示:在条件允许的情况下,qPCR可以作为MS首选的监测方法;当检测条件受限时,上述三种血清学方法同样也可以用于评估MS野毒感染状况,但对结果的判断受母源抗体水平、疫苗免疫状况、野毒感染时间等多重因素的影响,在结果判断时应进行综合分析。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

籼稻明恢63成熟种子愈伤组织的诱导及转基因水稻的抗性检测

利用不含附加营养成分的 2 ,4 D培养基 (2mg L)诱导明恢 6 3的成熟种子 ,9天预诱导后获得了大量的愈伤组织。利用基因枪辅助的土壤农杆菌转化法将天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)基因转入籼稻明恢 6 3的愈伤组织 ,并通过再生 (含有 3mg L 6 BA ,0 .5mg LABA和 1mg LNAA的N6培养基 )获得了转基因植物。Southernblot分析和Westernblot检测证明外源基因已经插入到T0代明恢 6 3的基因组中并获得了表达。初步研究结果表明 。

我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析

对肠道病毒 71型 (enterovirus 71 ,EV71 )中国 (深圳 )分离株SHZH0 3进行了全基因组 (未包括多聚腺苷尾 )74 0 6个碱基的核苷酸序列测定。结果表明 ,SHZH0 3株与其它肠道病毒 71型毒株相比 ,在编码区没有核苷酸的缺失和插入 ,其 5′UTR和 3′UTR区的长度和序列有一定的差异。核苷酸同源性比较结果表明 ,在P1区SHZH0 3株与SHZH98株、中国台湾流行株 (TW 2 0 86、TW 2 2 72 )的同源性较高 (分别为 92 .5 % ,90 .1 %和 87.9% ) ,与新加坡流行株SIN5 6 6 6、SIN5 86 5及标准株MS、BrCr的同源性则在 81 %左右 ,而与CoxsackievirusA1 6 (Cox .A1 6 )的同源性最低 (6 3.6 % )。氨基酸同源性比较结果表明 ,在P1区SHZH0 3株与Cox .A1 6的同源性最低 ,但在P2和P3区SHZH0 3株与Cox .A1 6的同源性最高。P1区的遗传进化分析表明 ,SHZH0 3株和中国台湾 1 998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近 ,属于同一型 (genogroup) ,而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远。

番茄转果聚糖合酶基因获得抗寒植株

从枯草芽孢杆菌毖Bacillus subtilis中分离克隆果聚糖合酶(levansucrase)基因sacB,构建置于CaMV35s启动子调控下的表达载体,通过农杆菌介导,将sacB基因导入番茄栽培品种碧娇。Southern杂交证明,目的基因已经整合到番茄基因组中。RT-PCR分析表明,sacB基因在转基因植株中获得转录。在含50mg·ml-1卡那霉素生根培养基中转化植株生根良好。抗冻试验、叶片电导率测定、多糖含量测定的试验结果均表明,果聚糖合酶基因赋予转基因番茄良好的抗寒性状。