我国分离的甲病毒YN87448毒株全部结构区基因核苷酸的序列测定及分析

Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株１９８６ 年分离自云南傣族５２ 岁女发热病人的血液标本，曾用血清学方法鉴定为披膜病毒科甲病毒属。用我们创立的单引物差异 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法及简并引物 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 法均已证明：该病毒为甲病毒属的辛德毕斯样病毒（ Ｓｉｎｄｂｉｓ － ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ） 。本研究从甲病毒属的病毒基因序列的共同保守区，设计４ 对引物。用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法扩增，再将扩增片段分别连结克隆到ｐ Ｇ Ｅ Ｍ－ Ｔ 载体。通过对４ 个克隆的测序完成了对 Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株的全部结构区基因序列的测定，结果表明：（１） Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒的全部结构区基因序列长度为４ ０５９ 个核苷酸（ 不包括多聚腺苷酸尾） ；（２） Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒的全部结构区基因与辛德毕斯病毒家族中毒力最强的、唯一能致成年小鼠１００ ％ 死亡的、南非分离的辛德毕斯样病毒 Ｓ Ａ Ａ Ｒ８６ 株相应基因的核苷酸序列同源性为９９ ％ ，但 Ｙ Ｎ８７４４８ 毒株不致成年小鼠死亡；（３） 二者基因结构上有一点大的差异是， Ｙ Ｎ８７４４８ 病毒位于基因组８ ６４１ｂｐ 处的结构区基因 Ｅ２ 和 Ｅ３ 之间多出３ 个核苷酸（ Ａ Ａ Ａ） ；（４） 与其它甲属病毒的进化树比较来看?

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34^+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。

重组AAV1/hFIX病毒制备及其体外转导培养细胞的实验研究

目的制备携带人凝血因子IX基因的重组AAV1病毒(rAAV1/hFIX),体外转导C2C12细胞并检测hFIX的表达。方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1/hFIX,体外转导C2C12细胞后,检测细胞上清中FIX的表达量。结果制备出了高纯度的rAAV1/hFIX病毒,转导C2C12细胞24h后在上清中即可检测到hFIX,连续检测了120h都有表达,24h最高表达量高达到(68.0±3.2)ng/24h。结论制备的rAAV1/hFIX病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFIX,为应用基因治疗载体治疗血友病B的体内实验奠定了基础。

重组AAV1-Luc病毒制备及体外转导培养细胞的特性

目的制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒(rAAV1-Luc),研究该病毒体外转导培养细胞的特性。方法通过"1株载体细胞/1株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,研究该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系,肝素对转导的拮抗作用、rAAV1的竞争抑制作用及丁酸钠对表达水平的增强作用。结果在一定范围内,随着rAAV1-Luc感染细胞的感染复数(MOI,即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(>107)反而使荧光素酶的表达水平下降。肝素不能特异性阻断rAAV1介导的荧光素酶表达。携带不同基因的2种rAAV1病毒相互具有明显的竞争抑制作用。丁酸钠可显著增强rAAV1介导的荧光素酶表达水平。结论该研究揭示了rAAV1载体一定的细胞转导特性,对应用rAAV1载体介导基因转移研究具有指导意义。

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的 运用噬菌体表面表达技术 ,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgGFab轻、重链基因 ,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段 ,并在E coli中进行分泌性表达。通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体 ,并进行序列测定。然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC L Fc上 ,转染昆虫sf 9细胞 ,利用杆状病毒 昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达 ,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白。结果 分离到一株Fab克隆AAVs 31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性 ,间接免疫荧光试验呈阳性 ,序列分析结果表明是一新的序列 ,所获得的基因为人源IgGFab基因 ,由Gamma链和Kappa链组成。表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性 ,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒 ,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白。结论 用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段 ,并在真核系统中表达了其全抗体 。

正痘病毒属成员血凝素分子的结构及分子进化途径的分析

利用DNA聚合酶链式反应(PCR)及其它分子生物学技术克隆了23株包括所有正痘病毒属成员在内的病毒血凝素(HA)基因.核苷酸序列分析及结构与功能的研究发现HA分子具有与细胞粘着分子超家族成员(CAM)相似的结构,其生物学功能主要与结构中的IgG结构域和广泛的O型糖基化结构有关.另外,以HA分子基因的核苷酸和其氨基酸序列为比较指标,首次在基因水平对正痘病毒的起源和进化途径以及病毒间的抗原相关性等进行了分析.基因的分子进化树和蛋白质系统分类树的演段揭示了病毒在宿主选择压力作用下的自然进化途径及相互间的亲缘关系,为进一步阐明正痘病毒的进化过程和控制与预防该类病毒性疾病的流行提供了有价值的依据.