血管生成抑制素基因工程大肠杆菌的高密度发酵研究

用 5L发酵罐研究了E .coliTG1 pBVA2和E .coliTG1 pBVK1 3的高密度培养工艺 ,确定了诱导及补料策略 ,在不降低外源基因表达量的前提下 ,工程菌TG1 pBVA2高密度发酵菌体干重为 1 6 8g L ,hAGN(K1 - 4)的表达量为菌体总蛋白的 2 4 1 % ,相当于 1 39g L ;同样的方法 ,工程菌TG1 pBVK1 3菌体干重可达 1 6g L ,hAGN(K1 - 3)占菌体总蛋白 2 5 8% ,相当于1 45g L。

可降解淀粉酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用

将酿酒酵母的rDNA片段,黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因表达盒及G418抗性基因表达盒重组进经过改造的质粒pSP72,构建酿酒酵母整合型质粒YIp4RGAn及YIp19RGAn,转化酿酒酵母实验室菌株GRF18、生产菌株JL108、SD和JM,获得能高效表达葡萄糖淀粉酶和分解淀粉的酿酒酵母基因工菌。Southern印迹分析证明,葡萄糖淀粉酶基因已整合进工程菌染色体。这些工程菌在含有20%淀粉的培养基中培养,产酒率都在11%以上。

影响根癌农杆菌介导的香蕉基因转化早期的主要因素

用含质粒载体pCAMBIA2 30 1的根癌农杆菌 (Agrobacteriuminoculation)转化“6 4 1”香蕉 (MusaAAACavendishsubgroupcv.6 4 - 1)的薄片外植体 ,通过测定GUS基因瞬时表达率 ,对转化早期的主要影响因素进行了研究。结果表明 :农杆菌EHA10 5较适合于介导转化。将薄片置于固体高渗培养基上培养 4h后 ,通过真空减压法使农杆菌接种于其上 ,获得了较高的瞬时表达率 (41 6 7% ) ,是对照 (8 33% )的 5倍 ,农杆菌悬液稀释 5倍用于转化较好 ,共培养 3d为宜。薄片外植体越靠近根部 ,瞬时表达率越高。而外植体预培养会降低瞬时表达率。

抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株

构建了一种新的植物高效表达载体pAM12 s1m ,其上携带有通过基因优化 (geneshuffling)技术获得的抗草甘膦突变基因 (aroAM12 )和抗虫人工合成重组Bt基因 (Bts1m)。aroAM12基因表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因表达由2E 35S启动子和Ω因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为外植体 ,采用农杆菌介导法将aroAM12和Bts1m基因导入棉花品种石远 32 1中 ,以aroAM12基因作为选择标记 ,草甘膦为选择剂直接筛选获得 5 2棵再生植株。PCR和Southernblot分析表明再生植株均整合有aroAM12基因 ,其中 38棵植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Westernblot分析进一步证明整合到植株中的两个基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。离体叶片草甘膦抗性和虫试实验证明 ,获得的转基因棉花对草甘膦和棉铃虫具有较强的抗性。

转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定

对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析。结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII。

油菜转抗草甘膦、抗虫基因获得双抗植株

以草甘膦为筛选剂,用农杆菌介导法将编码5烯醇式丙酮酸莽草酸3磷酸合成酶(EPSPS)的aroAM12基因和编码苏云金杆菌毒蛋白的Btslm基因导入到甘蓝型油菜优良品种湘油15号中。在用草甘膦对转化体进行筛选的基础上,对转基因再生植株进行了PCR检测、Southernblot和Westernblot分析,结果证明外源基因确已导入到该油菜品种中,而且表达了相应的蛋白。对转基因植株进行抗草甘膦、抗虫性鉴定的结果表明,转基因植株具有抗草甘膦、抗虫的双重特性。研究结果还表明抗草甘膦的aroAM12基因在植物基因转化中,既可以用作抗除草剂基因,又可以代替常用的抗生素标记,用作植物筛选标记基因。

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因 (aroAM12 )和人工合成重组Bt抗虫基因 (Bts1m)的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制 ,Bts1m基因的表达由 2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导 ,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中 ,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southernblot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因 ,约 70 %的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northernblot、Immunodotblot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达 ,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明 。

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌16S rRNA基因的RFLP分析

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的多样性通过不依赖于培养的分析而获得。将渗滤液中古细菌的16S rRNA基因片断(16S rDNA)选择性地扩增出来并用于构建16S rDNA克隆文库。文库内古细菌16S rDNA的遗传变异性通过RFLP分析(限制性内切酶Hha Ⅰ和HaeⅢ)而得到。80个随机选出的古细菌rDNA克隆子被划分为29个不同的RFLP型(组),其中最大的5个型共占所有被分析克隆子的53％左右,而其余24个型的丰度均处于相对较低的水平,其中16个型更仅含有1个克隆子。有关结果表明,对克隆16S rDNA片断的RFLP分析是评估复杂厌氧系统中微生物群落多样性的有力工具。

胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表达

对中国的一个胡萝卜品种进行了冷诱导前后幼苗总蛋白组成的比较、分析 ,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明两者在相对分子质量 36 0 0 0附近有一条蛋白带的差别。由此推测实验的胡萝卜品种在冷诱导过程中有抗冻蛋白 (AFP)表达。根据相关的研究结果设计引物 ,以胡萝卜幼苗基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增得到了长 10 99bp的抗冻蛋白基因。测序结果表明其与GenBank公布的afp序列仅有 3个碱基的差别。将此抗冻蛋白基因克隆进大肠杆菌表达载体pGEX4T1,在IPTG的诱导下表达出了含有AFP的约 6 0 0 0 0的融合蛋白 。

利用微波炉和煮沸法快速制备大肠杆菌基因组DNA PCR模板

利用微波炉和煮沸法可以简单、快速、有效地制备大肠杆菌基因组DNAPCR模板。用该模板做PCR具有很高的效率和良好的特异性。

根癌农杆菌介导苜蓿体胚转化及转基因植株再生

用含质粒载体pCAMBIA2301(带有受CaMV35S启动子调控的GUS基因和nptⅡ基因)的根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens转化晋南苜蓿MedicagosativaL cv Jinnan的体胚组织,发现负压处理有利于提高转化频率(可达35%),3批共158个体胚切块的转化实验共获得具有卡那霉素抗性的再生植株15株,经组织化学染色和分子检测,证实GUS基因已整合到转化植株基因组中,在芽、叶片、叶柄和根等组织中均有表达,并在土壤栽培过程中保持稳定的表达。

通过cDNARDA法分离和识别盐藻(Dunaliella salina)盐胁迫相关基因

采用cDNA代表性差异分析 (RDA)技术 ,对盐藻在盐胁迫时差异表达的基因进行了分离鉴定 .在分离到的 10个基因中 ,有 5个与已知基因同源 (包括叶绿素a b结合蛋白基因、蛋白磷酸酶I催化亚基基因和 3个核糖体蛋白基因 ) ,还有 5个未知功能基因则是首次在盐藻中被分离 .值得注意的是 ,所有这 5个已知基因的功能都与细胞分裂或盐胁迫有关 .结果表明 :取样时盐藻细胞仍处于恢复阶段 ,所分离到的基因对于盐藻耐盐可能具有重要意义 ;蛋白磷酸酶I的下调表达可能是盐藻调节离子平衡的一个重要过程和细胞分裂受阻的原因所在 ;盐藻减缓细胞分裂速度可能是为了减少能量消耗 ,以留出足够的能量来应对盐胁迫 ;其它 5个未知基因可能也与盐藻适应盐胁迫机制有关 .

快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

发展了一个利用煮沸法快速制备酵母质粒和基因组DNAPCR模板的程序 。

aroA基因的克隆和优化

除草剂草甘膦 (glyphosate ,N_phosphonomethylglycine )的靶标酶是由aroA基因编码的EPSP (5_烯醇式丙酮酰莽草酸_3_磷酸 ,5_enolpyruvylshikimate_3_phosphate)合成酶。采用先进的基因优化技术 ,以鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSP合成酶基因为模板 ,通过随机结合 ,交错延伸的PCR扩增过程 ,克服定点突变的局限性 ,使基因获得多位点突变 ,并使之在大肠杆菌中得到表达。对纯化后的表达产物的酶动力学性质的测定结果表明 ,获得了与作为模板的野生型相比 ,具有高得多的酶活力 (降低的Km (PEP) )和大大增强的草甘膦抗性 (升高的Ki(glyphosate) )

人纤溶酶原K1-3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle 1- 3 (K1- 3)基因插入融合表达载体pET - 17b ,获得重组质粒pET -K13 ,转化E coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下 ,人纤溶酶原K1- 3基因在E coliBL2 1(DE3,pET -K13)中获得高效融合表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 4% ,表达产物以包涵体存在 ,Westernblot证明重组蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性 .

与芒果子叶切段不定根形成相关基因的cDNA片段的克隆

在研究芒果子叶横切所形成的远轴面和近轴面的不定根形成时发现,只在近轴面形成不定根。该研究利用抑制性扣除杂交(suppressive subtractivehybridization,SSH)方法,以子叶切段远轴切面作为参照样品,近轴切面作为检测样品,构建正向差异cDNA文库,分离与芒果子叶切段不定根形成相关基因的cDNA片段。经Virtual Northern杂交分析,获得6个阳性克隆。序列分析和同源性比较结果表明这些cDNA片段均为首次报告,它们分别与转运蛋白、转录调控因子及酶基因的DNA序列同源。

快速制备水稻基因组DNA PCR模板的煮沸法

文章发展了一个采用煮沸法快速制备水稻基因组DNA PCR模板的程序,成功地从水稻基因组扩增到了相应基因。

人血管能抑素基因的克隆、表达及其表达产物的纯化和生物活性测定

以人胎盘脐带组织为材料 ,提取组织总RNA ,用net RT PCR方法合成人血管能抑素cDNA基因 ,将该cDNA克隆进pSP72载体获得重组质粒pSP72C ,DNA序列分析结果与预期序列一致。用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切 ,切下pSP72C上的血管能抑素cDNA ,插入pET 3c载体的相应位点获得重组表达质粒pETC ,转化E .coliBL2 1 (DE3 ) ,SDS PAGE分析显示 :在IPTG诱导下 ,血管能抑素基因获得了高效表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 2 7 9% ,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白复性以及SephadexG 75凝胶过滤层析等步骤后 ,获得了纯度达 91 4%的人血管能抑素。CAM实验证明 1 0 μg纯化蛋白就能显著抑制鸡胚新生血管生成。

水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因的序列和表达分析

以水稻(Oryza sativa)品种Cpslo17幼穗为材料,通过RT-PCR克隆了长度为698bp的编码水稻细胞质铜锌超氧化物歧化酶基因(OsCu/Zn-SOD)。序列分析表明其覆盖基因完整编码框,编码由152个氨基酸组成的蛋白,它与玉米(Zea maize)Cu/Zn-SOD基因序列的相似率为88%。TargetP和ChloroP预测编码蛋白N端无信号肽序列,且此编码区段有8个外显子和7个内含子。利用Swiss-Model站点预测OsCu/Zn-SOD三维结构,并分析其铜锌离子结合位点的结构。RT-PCR结果表明OsCu/Zn-SOD在水稻不同品种均有表达,但表达量存在差异,OsCu/Zn-SOD在Cpslo17的分裂旺盛的幼嫩组织如幼穗、开花期花序和未成熟种子中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,在愈伤组织中表达微弱。

大蕉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、鉴定和表达分析(英文)

为了研究苯丙氨酸解氨酶基因与大蕉(Musa ABB cv. Dongguandajiao)抗枯萎病的关系,利用 RT-PCR 和 RACE技术克隆了大蕉苯丙氨酸解氨酶基因全长 cDNA。此 cDNA 长 1 300 bp,包含一个长为 1 191 bp,编码 397 个氨基酸的完整开放阅读框(ORF),推导的氨基酸序列与水稻 PAL 基因氨基酸序列同源性达 89%,将此基因命名为 M-PAL。Southern杂交结果表明大蕉中存在一个包含 4-5 个 PAL基因的基因家族,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体 pET32(a+)中,表达的蛋白质分子量大小与推导的相一致,并且表达的蛋白质表现出 PAL 酶活性。对接种香蕉枯萎病菌 4 号生理小种(Fusarium oxysporumf. sp. cubense (FOC) race 4 )后大蕉叶片中 M-PAL基因的转录谱进行研究表明,在接种枯萎病菌后,M-PAL基因在叶片中的转录水平提高,因此推测 M-PAL基因的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。