东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性。方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段。PCR产物与pMD18 T连接,得到阳性重组载体pMD18 Myticin A。Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K Myticin A转化至宿主菌中。得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达。发酵上清进行Tricine SDS PAGE分析并用CM sepharose柱和Sephadex G 25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性。结果:获得重组载体pPIC9K Myticin A。高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K Myticin A经甲醇诱导后,Tricine SDS PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上。Western印迹法证实所表达样品为Myticin A。表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用。结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长。

Kininogen D5和TRAIL融合蛋白的克隆表达及生物学活性的研究

用重组PCR技术得到Kininogen D5和TRAIL的融合编码序列,将该DNA片段克隆到原核表达载体pMAL-c2,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,得到MBP-KT和MBP-TK,经AmyloseResin亲和层析柱层析,得到初步纯化的融合蛋白。结果表明MBP-KT对胰腺癌细胞1990有明显的杀伤作用其作用的ED50为20 ng/ml,而MBP-TK对1990的抑制作用不明显;同时,MBP-KT和MBP-KD5对内皮细胞ECV304有明显的抑制作用,MBP/KT作用于ECV304的ED50为0.1μg/ml,MBP/KD5作用于ECV304的ED50为9.5μg/ml,但是MBP-TK和TRAIL几乎无作用,表明融合蛋白KT既具抗肿瘤作用又有抗新生血管的作用。本研究为进一步开发靶向性杀伤肿瘤药物奠定了基础。

迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

目的:研究迷迭香酸对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。方法:将20、40、60μg/ml迷迭香酸或1μg/ml阳性对照别嘌呤醇,分别加入黄嘌呤溶液(测尿酸生成量:1 mmol/L;测超氧离子:50μmol/L)和0.1 U/ml黄嘌呤氧化酶中,用生化仪测定5min尿酸生成量和超氧离子生成(NBT显色法)。在1 ml 2×105/ml HL-60细胞悬液中加入100μl 6 mol/L黄嘌呤、100μl0.1 U/ml黄嘌呤氧化酶、500μg/ml迷迭香酸,分别以AnnexinⅤ-PI双标试剂盒法(以1μg/ml别嘌呤醇为阳性对照)或细胞周期法(以100 U/ml SOD为阳性对照)测定细胞凋亡率。结果:迷迭香酸显著抑制尿酸生成和超氧离子引起的NBT显色,两种方法测得其IC50分别为56μg/ml和21μg/ml;对细胞凋亡的抑制率均在40%以上。结论:迷迭香酸是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂。

玄参中苯丙素苷XS-8对兔血小板cAMP和兔血浆中PGI_2/TXA_2的影响

玄参属(Scrophularia L.)是玄参科(Scrophulariaceae)的一个大属,世界上共有200种以上,我国约有40种[1].玄参属有许多药材作为民间药物治疗各种疾病[2].我们对玄参的化学成分进行了较为系统的分离,发现其主要成分为环烯醚萜苷和苯丙素苷.药理实验中证实苯丙素苷能抑制血小板聚集和大鼠中性白细胞花生四烯酸(AA)代谢物白三烯(LTB4)的生成[3].本研究在此基础上,进一步探讨苯丙素苷抗血小板聚集的作用机制.

玄参中环烯醚萜Epibueropyridinium A对醛糖还原酶的抑制作用

目的:研究Epibueropyridium A对醛糖还原酶的抑制作用。方法:醛糖还原酶通过硫酸铵分级沉淀从牛眼晶状体中提取,在含有DL-甘油醛、醛糖还原酶、NADPH的反应体系中,加入一定浓度的Epibueropyridium A,通过340 nm处光密度的变化来反映Epibueropyridium A对酶活性的抑制作用。阳性对照为依帕司他,采用双倒数作图的方法确定抑制类型,二次作图法求Ki,以抑制剂浓度对抑制率作图求IC50。结果:Epibueropyridium A能显著抑制醛糖还原酶的活性,为竞争性抑制,其半数抑制剂量IC50为4.2μg/ml,Ki值为4.88μg/ml。结论:Epibueropyridium A是醛糖还原酶的竞争性抑制剂。

玄参中苯丙素苷对大鼠肝损伤细胞凋亡的影响

目的 :观察玄参中苯丙素苷对大鼠肝损伤细胞凋亡的影响。方法 :采用D 氨基半乳糖 (D Gal)造成大鼠急性肝损伤模型 ,观察玄参中苯丙素苷对此模型肝细胞凋亡及相关基因表达的影响。结果 :玄参中苯丙素苷明显抑制模型肝细胞凋亡 ,上调bcl 2蛋白表达 ,下调Fas/FasL的表达。结论 :玄参中苯丙素苷抗肝损伤细胞凋亡可能与其调控肝细胞凋亡相关基因有关。

玄参中苯丙素苷Acteoside对小鼠高尿酸血症的影响

目的探讨玄参中苯丙素苷Acteoside对小鼠高尿酸血症的影响及可能的作用机理。方法从玄参根中分离提取苯丙素苷成分Acteoside,采用次黄嘌呤造成小鼠高尿酸血症,观察Acteoside对小鼠高尿酸血症的影响,并进一步从体外观察Acteoside对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。结果Acteoside能显著降低高尿酸血症小鼠体内的尿酸水平,体外实验显示其对黄嘌呤氧化酶有明显的抑制作用,IC50为12.25μgml-1。结论玄参中Acteoside在小鼠高尿酸血症中的降尿酸作用可能与其抑制黄嘌呤氧化酶作用有关。

人组织era基因mRNA的表达谱

目的 研究人 era基因 m RNA在不同组织、不同细胞系的表达水平 .方法 用 α([32 p]d CTP标记人 era编码区基因作为探针 ,分别用 Northern杂交和斑点杂交分析含 12种不同成人组织 m RNA的 Multiple tissue northern(MTN)blot膜和含 76种成人、胎儿及常用细胞系 m RNA的 Multipletissue expression (MTE) array膜 ,并用同位素扫描系统对杂交结果进行图像分析 .结果 Northern blot杂交所检测的 12种组织中均有位于 2 .2 kb处的杂交条带 ,斑点杂交显示人era m RNA在所检测的 76种组织中均有表达 ,但表达水平有很大差异 ,在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达 .结论 人 era m RNA表达于所有检测的组织或细胞系 ,可能为一种组成性表达的基因 .

贻贝多糖对老龄SD大鼠抗衰老作用

目的:研究贻贝多糖对老龄大鼠抗衰老的生物效应。方法:建立24个月龄SD大鼠自然衰老模型,分为老年正常对照组、贻贝粉组(1g/kg)、贻贝多糖低剂量组(200mg/kg)、贻贝多糖高剂量组(400mg/kg),3个月龄大鼠5只为青年对照组,灌胃给药(1次/d);观察大鼠心脏、肝脏、肾、脾的脏器指数,对其心脏、肝脏进行切片观察病理学变化,测定大鼠血清及肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)水平,测定血清主要生化指标。结果:与老年组相比,贻贝多糖高剂量组的心脏、肝脏病理切片H-E染色观察未见明显衰老性改变,其血清、肝脏中SOD、GSH-Px水平增高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01)。结论:贻贝多糖具有抗衰老作用,抗氧化作用可能是其抗衰老作用的机制之一。

丹参总酚酸抑制大鼠肾间质纤维化的初步观察

目的观察丹参总酚酸对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化的影响。方法将40只健康、雄性SD大鼠随机分为4组分别为UUO组、假手术组(SOR)、阳性对照依那普利(ACEI)组和丹参总酚酸样品(TSA)组,术前分别给UUO组和SOR组灌生理盐水,ACEI组和丹参总酚酸组分别灌胃ACEI[6mg/(kg·d)]和丹参总酚酸[20mg/(kg·d)],连续8d。术后第7天分别处死各组大鼠用免疫组织化学方法测定TGF-β1的表达情况。行H-E和Masson染色,动态观察肾间质病理学改变。结果丹参总酚酸组和ACEI组TGF-β1的表达量与模型组(0.22±0.06)比较有明显的下降(P<0.05),结果分别是1.38±0.26和1.38±0.26。丹参总酚酸能显著减少UUO大鼠肾小管间质TGF-β1的表达,减轻胶原在肾间质的沉积,改善了肾脏病理改变。结论丹参总酚酸对UUO所致的大鼠肾脏纤维化的形成有明显的抑制作用,其作用可能跟降低TGF-β1的表达有关。

人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定

目的 :在大肠杆菌表达人lrg ,制备鉴定人Lrg免疫血清 .方法 :构建pcTAT lrg重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白 ;对表达的融合蛋白采用镍柱和SDS PAGE纯化 ;以纯化蛋白作为免疫抗原 ,对新西兰白兔实施多次免疫 (间隔时间分别为 1mo,3wk ,2wk) .结果 :获得兔抗人Lrg免疫血清 .经过ELISA和WesternBlot检测 ,效价在 1∶1 0 0 0以上 .真核细胞实验表明 ,6His TAT Lrg蛋白具有良好的穿透性 ,可以在 30min内从培养液进入细胞质 ;免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白 ;兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测 .结论 :制备得到兔抗人Lrg免疫血清 。

人抗HER2单链抗体/精氨酸九聚体融合蛋白的基因构建、表达及鉴定

目的:构建人源性抗HER2单链抗体(scFv)/精氨酸九聚体(9R)融合蛋白基因,在大肠杆菌里表达纯化并检测该融合蛋白的活性。方法:采用PCR的方法,扩增融合基因scFv-9R,将获得的基因克隆入原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,通过Ni-NTA螯合层析纯化,透析复性,超滤浓缩。ELISA分析scFv-9R融合蛋白抗原亲和活性,凝胶迁移实验检测scFv-9R融合蛋白与siRNA结合活性。结果:成功构建了人源性抗HER2 scFv-9R融合基因,经IPTG诱导后在M15中以包涵体形式表达。表达的目的蛋白scFv-9R能与HER2抗原结合,同时具有siRNA结合能力。结论:scFv-9R具有结合抗原与siRNA双重活性,为靶向递送siRNA的研究奠定了基础。

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.

哮喘气道上皮杯状细胞合成GM-CSF及其调控机制的研究

目的 观察哮喘小鼠气道上皮杯状细胞合成粒细胞 /巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)的能力 ,探讨钙激活Cl-通道(CLCA)在合成中的调控作用。方法 取成年雄性BALB/c小鼠 ,采用卵蛋白致敏法制备哮喘模型。AB PAS特染法检测哮喘小鼠小支气管杯状细胞的分布 ;同一解剖部位采用免疫组化染色法检测GM CSF的表达。体外培养人气道黏液上皮细胞系NCI H2 92 ,采用含人hCLCA1的重组质粒pIRES2 EGFP/hCLCA1转染该细胞。筛选到稳定表达hCLCA1的细胞后 ,免疫组化法及RT PCR法检测该细胞GM CSF的表达、转录水平。设非转染细胞和CLCA阻断剂NFA干预的转染细胞为两个对照组。结果 哮喘小鼠气道杯状细胞GM CSF免疫组化染色为阳性。转染hCLCA1细胞的GM CSF表达与转录水平明显高于两个对照组 ;NFA能抑制转染细胞GM CSF的表达和转录。结论 哮喘气道上皮杯状细胞能合成GM CSF ,特定CLCA表达升高是促进GM CSF合成的机制之一。

GST-Gankyrin融合蛋白的原核表达及抗体制备

目的:为进一步研究在肝癌上过表达的癌相关基因Gankyrin的功能,进行GSTGankyrin融合蛋白表达载体的构建、原核表达、及抗体制备.方法:采用逆转录PCR(RTPCR)法从人肝癌细胞系hepG2中扩增GankyrincDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX4T2中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导获得表达,并将Gankyrin蛋白免疫家兔,经过Westernblot检测抗Gankyrin抗体的产生.结果:成功构建了Gankyrin原核表达载体,并在大肠杆菌DH5α中获得表达,Westernblot检测证实获得了抗Gankyrin抗体.结论:成功表达了Gankyrin蛋白并制备了其特异性抗体.

含Arg9的人抗HBsAg单链抗体／EGFP融合蛋白基因的构建、表达和内化作用的研究

目的:构建、表达和纯化带有转膜结构域Arg9的ScFv14／EGFP融合蛋白,并对纯化产物的亲和'活性和内化作用进行研究。方法:将Arg9的编码序列分别重组到ScFv14／EGFP基因的5'端、3'端和二者之间,将它们分别克隆入原核表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS进行诱导表达和纯化,用间接ELISA方法检测表达产物与HBsAg的亲和活性,并用间接免疫荧光检测纯化蛋白的内化活性。结果:经测序及酶切鉴定证实4种融合基因序列完全正确;SDS-PAGE和Western blot证实4种融合基因成功表达和纯化;间接ELISA检测证实4种融合蛋白均具有HBsAg结合活性,间接免疫荧光检测显示N端带有Arg9的融合蛋白有较强的内化作用,而且不内化进入HBsAg非表达的细胞。结论:成功构建、表达和纯化了ScFv14／EGFP融合蛋白和3种带有Arg9的ScFv14／EGFP融合蛋白,纯化产物均具有抗原HBsAg亲和活性,N端带有Arg9的融合蛋白与靶细胞作用有较强的内化作用。

成纤维细胞中hEra-EGFP融合蛋白的表达定位

目的 研究人 era基因在体外培养细胞中的定位 .方法 将人 era基因克隆入带绿色荧光蛋白 (EGFP)荧光标签的真核表达载体 p SMEGFP,使其位于 EGFP的 N端 ,转染NIH3T3细胞 ,于转染后 2 4和 36 h分别用荧光显微镜观察 .结果 成功构建了 EGFP- h Era融合蛋白的表达载体 ,转染细胞后可见融合蛋白位于细胞的胞质近核膜处 .结论 用EGFP融合蛋白的方法初步将 h

高密度发酵制备重组人OCIF活性域多肽融合蛋白

以补料 分批发酵方式在 3 7L发酵罐上实现了人破骨细胞形成抑制因子活性域多肽(OCIFAD)的高密度发酵融合表达。通过参数控制。发酵液最终OD6 0 0 达 1 2 5 (相当于 35g湿菌体 L) ,表达量占菌体总蛋白 40 %左右 ,含量超过 0 6g L ,并且 90 %呈可溶性而直接具有生物学活性。直链淀粉树脂亲和层析法一步纯化 ,纯度达 90